Summary
فموي معدي النظام العصبي (STNS) من السلطعون جونا (
Abstract
العقدة فموي معدي (STG) هو نموذج ممتاز لدراسة التفاعلات الخلوية وشبكة لأنه يحتوي على عدد قليل نسبيا من الخلايا (ما يقرب من 25 في الشفق جيم) والتي تتميز بشكل جيد. الخلايا في STG المعرض مجموعة واسعة من المخرجات ومسؤولة عن تصرفات السيارات المعدة. المعدة المعدة يحتوي على طاحونة الطعام الذي ينهار مع ثلاثة أسنان الداخلية ، وبوابة المعدة التي بتصفية الطعام قبل أن تصل إلى المعي المتوسط. وتنتج نتيجتين STG الايقاعي للسيطرة على مصنع للبواب المعدة والمعروفة باسم مولدات نمط المركزية (CPGs). يمكن لكل خلية في STG المشاركة في أحد أو كل من هذه الإيقاعات. هذه CPGs تسمح لدراسة تعديل العمليات العصبية ، التوازن ، وتقلب الخلوية وشبكة ، وتطوير الشبكة ، واستعادة الشبكة.
يتم تشريح الجهاز العصبي فموي معدي (STNS) من جونا السلطعون (سرطان الشفق) في جزأين ، وتشريح الجسيمة والغرامة. في تشريح الإجمالي يتم تشريح المعدة بالكامل من السرطانات. أثناء تشريح الغرامة يتم استخراج STNS من المعدة باستخدام مجهر التشريح والتشريح الدقيقة الأدوات (انظر الشكل 1). ويتضمن STNS STG ، والعقدة المريء (خطأ في مرماه) ، والعقد صواري (ترس) وكذلك الأعصاب التي يعصب عضلات المعدة. هنا ، وتبين لنا كيفية إجراء تشريح كامل للSTNS استعدادا لتجربة الكهربية حيث ستسجل الخلايا في STG من intracellularly والأعصاب الطرفية وستستخدم للتسجيلات خارج الخلية. ويظهر هذا الأسلوب السليم من أجل العثور على الأعصاب المطلوب فضلا عن تقنية لدينا desheathing العقدة للكشف عن وsomata neuropil.
Protocol
1. تشريح الإجمالي
- مكان السلطعون على الجليد لمدة 30 دقيقة للنظم مملة الحسية والحركية للحيوان. تحيط بها من جميع الجوانب مع الثلج. يجب ارتداء القفازات عند التعامل مع السلطعون.
- تحضير للتشريح الإجمالي وذلك بطرح عموم التشريح والأدوات التي سوف تستخدمها. Rongeurs ، لا بد من قطع العظام المقص ، مقص صغير ، ملقط مسنن ، ملعقة مع حافة مدبب ، وهو طبق Sylgard السوداء المغلفة ، ودبابيس الحشرات.
- إزالة السرطان من دلو الثلج بواسطة الساق الخلفيتين لمنعها من معسر وضعه في مقلاة تشريح.
- إزالة مخالب أول من التواء كل واحد إلى الداخل. ثم إزالة كل الساق باستخدام حركة التواء نفسه.
- باستخدام rongeurs ، إزالة لفك تغطية الفم. أيضا إزالة maxillule الناعمة.
- باستخدام rongeurs مرة أخرى ، تبدأ من نهاية الخلفي الجانبي للدرع والحصول على قبضة جيدة على حافة منه. تضييق الخناق مع rongeurs وكسر قطعة من درع قبالة. تأكد من إزالة ما يكفي من درع للسماح بدخول ملعقة الافتتاح. تواصل إزالة حافة درع يصل الى العينين وكرر على الجانب الآخر.
- مع الجانب مدبب من البسط ، كشط بلطف الأنسجة اللينة الداخلية بعيدا عن سطح درع الظهرية. تبقي الملعقة في اتصال مع درع لتجنب إتلاف STNS. استخدام rongeurs لكسر بعيدا عن أجزاء من درع التي تم فصلها عن الأنسجة. منفصلة أيضا بعض الأنسجة اللينة من درع بطني مع التأكد من فصل أي العضلات المقربة إرفاق الأنسجة لدرع.
- الانفصال درع الظهرية والخلفي بقدر القلب حيث هناك نوعان من عظيمات صغيرة جاحظ من درع. خفض بقدر الأمامي ممكن. استقرار سيفالون ("الوجه") مع إصبع واحد في حين أن الابتعاد أكثر أجزاء الأمامي للدرع الظهرية.
- على الجانب البطني للدرع ، سحب mandibles في وقت واحد خلال ترسيخ rongeurs الصعود إلى الفك السفلي ، التواء منهم إلى الخارج لإزاحة الفك السفلي من الخليقاء المرفقة ، وجرها بعيدا. يجب أن يرفق اثنين العظيمات الطويلة مع عضلات الفك السفلي للاستخراج في حال القيام به بشكل صحيح.
- منفصلة بعيدا عن الأنسجة من الجانبين من سيفالون قرب العينين باستخدام الملعقة. مع مقص تشريح الصغيرة ، وقطع النسيج عبر أقرب إلى التلال من ossicle وطبقة بعد طبقة ممكنة.
- بقية السلطعون ضد جدار من المقلاة ودعم تشريح أنه حتى في تأمين مكان (يمكن أن تستخدم لهذا مخالب). قطع الشفا ("الشفة العليا") بعيدا عن الخليقاء التأكد من عدم ترك أي نسيج المرفقة. قطع العظم باستخدام مقص جعل اثنين من التخفيضات قطري في درع البطني لإزالة سيفالون.
- اتخاذ شفا مع ملقط مسنن وقطع الشفة ("الشفة السفلى") بعيدا عن ossicle على الجانب البطني. ثم رفع الشفة بلطف بعيدا عن درع وبطني المتبقية. استخدام مقص صغير لفصل جزء من المعدة بطني من الأنسجة المبطنة للدرع. عندما الأمبولات البواب مرئية ، وقطع المعدة بعيدا عن الأنسجة على جانبي حتى يتم استخراج المعدة من السرطانات.
- ما زالت تحتجز المعدة بواسطة ملقط مع الشفة ، وبقية المعدة ضد كف اليد وسكب المياه المالحة إلى الفم. هذا توسع المعدة ويسهل قطع مفتوحة. قطع من فتح في الفم باستمرار بين الحق من خلال بوابة المعدة ossicle بين الأمبولات. ثم قص أسفل قطريا من خلال فرعين فؤادي. قطع نصائح للأسنان ثلاثة داخل المعدة.
- مكان الصعود إلى المعدة ، سوداء كبيرة طبق Sylgard المغلفة ، وداخل المعدة إلى أسفل. دبوس أسفل الزوايا الخمسة للتحضير مع دبابيس الحشرات وملء الطبق مع المالحة الباردة ، وتخبط في إعداد بأكمله (انظر الشكل 1).
2. غرامة تشريح
- وهناك حاجة ، الصغرى ، تشريح أدوات تشريح الغرامة. على وجه الخصوص ، وهناك حاجة إلى مقص وملقط فصل الربيع وكذلك حامل إبرة دبوس مع التنغستن. وينبغي أيضا واضحة ، Sylgard المغلفة ، طبق بتري وبعض المسامير الأسلاك غرامة قد أعدت.
- تبدأ في أدنى التكبير ، تبدأ تعلق اللوحات بالقرب من أسفل الشفة التي كان يتم فتح الفم. ترتيب بقية الدبابيس لجعل إعداد مشدود ودبوس أي مجال من المجالات الأخرى الضرورية.
- رفع بعناية رصدت اللحمة التي تغطي الجزء السفلي من إعداد وتقليم ذلك عبر ترك بقعة من اللحمة مع اثنين من بقع بيضاء.
- قشر تصل الصفراء ، والأنسجة ، ناعم الغشائي بالقرب من الجزء السفلي من التحضير. وترد في mvns ضعيف على الجانب السفلي من هذا النسيج. منفصلة بعناية mvns من النسيج الأصفر كما هو جذبه. اتبع النسيج الأصفر وخفض ما يصل الى جانب المخ.
- متابعة عمليات كثيفة تخرج من الدماغ التي تمتد laterallي. هذه هي الأعصاب commisural. حالما يتم التوصل في نهاية العصب صواري ، إزالة كتلة الأنسجة الاسفنجية من البيض ، أنه قد تم قطع بعيدا من الجانب من الدماغ.
- حيث أيونات وأبناء تلبية التروس ، وقطع المسافة في العضلات والأنسجة للكشف عن طول الأيونات والأبناء.
- عودة الى التصحيح وقطع اللحمة رصدت تشغيله. هذا يجب أن يترك فتحة في الشرايين المحيطة STG. قطع طريق فتح فصل العضلات اللذين يحيطان STG. رفع نهايات هذه العضلات وقطع الحق تحتها للفصل بينهما من الشريان وفضح alns وأغنيس. فصل العضلات المحيطة بقدر ما يصل الغضروف الكذب على STN.
- قطع النسيج الشرايين المحيطة وصولا الى STG DGN للmvns ، حيث ، ويلتقي DVN. العمل باستمرار على DVN lvns وقطع طريق الأنسجة ، وبيضاء تغطي lvns الحساسة.
- تحديد موقع PSN خلال ossicle بالقرب من الجزء السفلي من التحضير. يمكن أن تستخدم لتحديد PSN lvn ومفرق dlvn.
- اتبع dlvn المقبل وصولا الى تحديد موقع PYN وPDN. وغالبا ما PYN يلتف حول أمبولة البواب الى فتح. وPDN الشوك الخروج من dlvn وبين أمبولة البواب وصمام البواب عضلات القلب. ترك بعض العضلات المرفقة واحدة من هذه الأعصاب لأنه لا يمكن الخلط بسهولة عندما يتم نقل لإعداد طبق Sylgard واضحة.
- بمجرد أن يتم كشف كل من الأعصاب ، وقطع أية اتصالات المتبقية بين STNS الأعصاب والأنسجة وغير المرغوب فيها من المعدة. التحرك بعناية STNS بعيدا عن باقي المعدة ، وقطع أية اتصالات تفويتها.
- حالة الطبق Sylgard واضحة مع كتلة من الأنسجة المتبقية في المعدة عن طريق فرك ما يزيد على سطح Sylgard Sylgard حتى لا يشعر بأنه لزجة جدا أو جافة. Sylgard هو مسعور وSTNS ستلتزم بشدة لأنه إذا لم يتم تكييف الطبق Sylgard المغلفة بهذه الطريقة.
- إضافة بعض المالحة الباردة إلى الطبق. الاستيلاء على نهايات الأعصاب العلوي من صواري مع ملقط وتقديم STNS إلى صحن Sylgard واضحة.
- دبوس يسقط على STNS Sylgard. قطع الدماغ من الأعصاب صواري واستخدام الدبابيس minuten لتأمين تنتهي أربعة من التروس اولا القضاء. تأكد من أن يتم إعداد الجانب الأيمن من قبل التحقق من أن يتم الإشارة إيفان يصل بعيدا عن Sylgard. ينبغي للخروج DGN قليلا تحت STG عندما STG هو الجانب الأيمن الأعلى. دبوس بقية العصب تغلق منخفضة مع المسامير الأسلاك الدقيقة.
- نظيفة من أي العضلات أو الأنسجة المتبقية من STNS.
- Desheath في STG باستخدام دبوس وحامل ، ودفع غرامة معقوف قليلا الإبرة التنغستن. جعل ثقب صغير في زاوية من غمد STG بعيدا عن أجسام الخلايا واستخدام ذلك للحصول على ثقب بين طبقات الغلاف. قطع بعناية رفرف من غمد فصل لفضح neuropil STG والهيئات الخلية.
- دبوس أي من اللوحات غمد وصولا الى زيادة إمكانية الوصول إلى الأجهزة المحمولة ولتحقيق الاستقرار في STG للتسجيلات داخل الخلايا. إعادة دبوس بقية STNS ضمان أن كل العصب مشدود ومتباعدة بشكل جيد لتسجيل خارج الخلية (انظر الشكل 3).
3. النتائج
- من الناحية المثالية ، ينبغي لجميع الأعصاب تكون خالية من النكات والضرر ، وخصوصا تلك التي سيتم تسجيلها من. وينبغي أن أيا من تشابك الأعصاب أو الملتوية. يجب أن تكون سليمة STG مع كل من خلايا مرتبة في تشكيل حية حول neuropil. وSTNS سليمة غير متناظرة على الصعيدين الثنائي ويشبه أنيسيان مع lvns والساقين ، وmvns مثل الأسلحة ونهاية الأمامي كرئيس.
الاختصارات :
| STNS | الجهاز العصبي فموي معدي |
| STG | فموي معدي العقدة |
| COG | صواري العقدة |
| OG | العقدة المريء |
| mvn | العصب الناصف البطين |
| أيون | المريء السفلي العصب |
| نجل | المريء العصب متفوقة |
| AGN | المعدة العصبية الأمامية |
| ن. | العصب الأمامي الجانبي |
| DGN | المعدة العصبية الظهرية |
| DVN | العصب الظهري البطين |
| lvn | البطين الوحشي العصب |
| PSN | الخلفية المعدة العصبية |
| PYN | البواب العصب |
| PDN | البواب موسع العصب |
| dlvn | الظهرية فرع من العصب البطين الجانبي |
| إيفان | العصب السفلي البطين |
الشكل 1 : رسم بياني يوضح الموضع التقريبي للSTNS في المعدة قبل تشريح.
الشكل 2 : مخطط للعضلات مختلفة في الجزء السفلي من المعدة وتراكب للSTNS في ضوء أخضر. يتم سرد كل نوع من الخلايا في العضلات مع STG من المعروف أنها يعصب. هذه الخريطة هي مفيدة عند التخطيط لتشريح الأعصاب التي تحمل إشارة من خلية معينة (مجاملة من المختبر نديم).
الشكل 3 : رسم تخطيطي للSTNS مع أقطاب كهربائية داخل وخارج الخلية الآبار (من ماردر وبوشر ، 2007).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تشريح STNS هو الخطوة الأولى في إجراء عملية الكهربية أو التجربة المناعية ، أو للحصول على خلايا للثقافة الخلية. بغض النظر عن التجربة المقصود ، فإن تشريح الإجمالي دون تغيير. ومع ذلك ، قد يختلف تشريح غرامة. من المهم أن تخطط للمستقبل من الوقت الذي خلايا الأعصاب ، والتي سوف سجل من. معظم الخلايا العصبية في STG والعمليات التي يعصب العضلات واحد على الأقل في المعدة (انظر الشكل 2) ، وتصنف وفقا لاهدافها معصب. لذا ، هناك حاجة للتحقق من خارج الخلية التسجيلات كاملا هوية الخلية التي يتم تسجيلها intracellularly. وتستخدم تردد الإيقاع البواب ومتانة لمراقبة الحالة الصحية للإعداد. لذلك ، العديد من التجارب تشمل تسجيلات خارج الخلية من lvn. يشيع استخدام DGN لرصد إيقاع المعدة. وغالبا ما تكون حاسمة STN لمعظم التجارب لأن هناك العديد من الخلايا modulatory في النهاية الأمامية للSTNS وقطع العصب الذي يمكن أن يسبب إيقاعات البواب والمعدة لوقف أو تصبح غير منتظمة.
على الرغم من أن الترتيب الذي تتم الخطوات في تشريح غرامة ليست مهمة ، نجد أنه من الأسهل لإزالة STNS دون ضرر عن طريق الحفاظ على نهايات الأعصاب الطرفية ترتكز على العضلات حتى بعد أن تم قطع STG من المناطق المحيطة الأنسجة. هذا يحافظ على ما يكفي من STG وSTN مشدود إلى بأمان وسهولة إزالة العضلات والأنسجة المحيطة بها.
مرة واحدة في إعداد الطبق Sylgard واضحة ، يجب إزالة أي نوع من الأنسجة التي لا تزال على STNS لتفادي أي تشويش مع الأقطاب أثناء التجربة. كما أنه من الأسهل الحصول على جيد ، والتسجيلات مستقرة عند إعداد معقود على النحو مشدود ممكن دون التسبب في ضرر للأعصاب. فمن الأهمية بمكان أن يكون مقيد STG أسفل آمن من قبل alns مع دبابيس قصيرة لتوفير الوصول إلى أقطاب داخل الخلايا مثل الخلايا أكبر عدد ممكن. فمن الأفضل أن يشرح ما لا يقل عن جزء من أي من الأعصاب التي تنشأ من STG حتى لو لم تكن هناك حاجة لتسجيل تلك الأعصاب. يمكن أن توفر المزيد من المراسي باستقرار STG على طبق. فمن الأفضل الاحتفاظ بها قصيرة نسبيا لأقصى قدر من الدعم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نحن نعترف بامتنان أعضاء مختبر ماردر. نشكر مستشار لدينا ، والدكتور حواء ماردر ، للحصول على الدعم والتشجيع لها. وأيد هذا البحث من قبل المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية المنح NS - 17813 - 058110 وNS.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Black Sylgard 170 | Other | Dow Corning | 170 | Gross Dissection |
| Fine Scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Insect Pins size 6 | Surgery | Fine Science Tools | 26000-65 | |
| Mayo Scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14110-17 | |
| Micro-Spatula | Surgery | WARD’s Natural Science | 15 V 4313 | |
| Rongeurs | Surgery | Fine Science Tools | 16000-14 | |
| Tissue Forceps | Surgery | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| Fine Tungsten Wire (0.001 in. diameter) | Surgery | California Fine Wire Company | Fine Dissection | |
| Forceps #5 | Surgery | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Minuten Pins | Surgery | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Moria Spring Scissors (7mm blades) | Surgery | Fine Science Tools | 15370-52 | |
| Petri Dish (100x15mm) | Other | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Pin Holder | Surgery | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Super fine forceps #5SF | Surgery | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Sylgard 182 | Other | Dow Corning | 182 | |
| Tungsten Needles | Surgery | Fine Science Tools | 10130-05 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Wild | MC3 | Misc. |
| Jonah Crab (C. borealis) | Animal | Commercial Lobster |
References
- Harris-Warrick, R. M., Marder, E., Selverston, A. I., Moulins, M. Dynamic Biological Networks: The stomatogastric nervous system. , MIT Press. Boston. (1992).
- Marder, E., Bucher, D. Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs. Annu. Rev. Physiol. 69, 291-316 (2007).
- Maynard, D. M., Dando, M. R. The structure of the stomatogastric neuromuscular system in Callinectes sapidus, Homarus Americanus and Panulirus argus (Decapoda crustacean). Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 268 (892), 161-220 (1974).
- Selverston, A. I., Russell, D. F., Miller, J. P. The Stomatogastric Nervous System: Structure and function of a small neural network. Prog. Neurobiology. 7, 215-290 (1976).
