Summary
Het stomatogastric zenuwstelsel (STNS) van de Jona krab (
Abstract
De stomatogastric ganglion (STG) is een uitstekend model voor het bestuderen van cellulaire en interactie met het netwerk, want het bevat een relatief klein aantal cellen (ongeveer 25 in C. borealis) die goed worden gekarakteriseerd. De cellen in de STG vertonen een breed scala aan uitgangen en zijn verantwoordelijk voor de motorische acties van de maag. De maag bevat de maag molen die voedsel afbreekt met drie interne tanden, en de pylorus, die het voedsel filtert voordat het de middendarm. De STG produceert twee ritmische uitgangen naar de maag molen en pylorus bekend staat als centrale patroon generatoren (CPGs) controle. Elke cel in het STG kunnen deelnemen aan een of beide van deze ritmes. Deze CPGs maken voor de studie van neuromodulatie, homeostase, cellulair en netwerk variabiliteit, netwerk ontwikkeling en net te herstellen.
De dissectie van de stomatogastric zenuwstelsel (STNS) van de Jona Noordzeekrab (Cancer borealis) gebeurt in twee delen, de grove en fijne dissectie. In de bruto-dissectie de gehele maag wordt ontleed uit de krab. Tijdens de fijne dissectie van de STNS wordt gewonnen uit de maag met behulp van een dissectie microscoop en micro-dissectie-instrumenten (zie figuur 1). De STNS omvat de STG, de slokdarm ganglion (OG), en de commissural ganglia (COG) en de zenuwen die de maag spieren innerveren. Hier laten we zien hoe een volledige ontleding van de STNS ter voorbereiding van een elektrofysiologie experiment waarbij de cellen in de STG zou worden opgenomen van intracellulair en de perifere zenuwen uit te voeren zou worden gebruikt voor extracellulaire opnamen. De juiste techniek voor het vinden van de gewenste zenuwen is zowel getoond als onze techniek van desheathing het ganglion aan de somata en neuropil onthullen.
Protocol
1. Bruto Dissection
- Plaats een krab op ijs gedurende 30 minuten te saai de zintuiglijke en motorische systemen van het dier. Surround het aan alle kanten met ijs. Handschoenen worden gedragen bij het hanteren van de krab.
- Bereid je voor op de bruto-dissectie door het leggen van de dissectie pan en de tools die u gaat gebruiken. Rongeurs, zijn bot snijden schaar, kleine schaar, pincet getande, een spatel met een conische rand, een zwart Sylgard-gecoate schaal, en insecten pennen nodig.
- Haal de krab uit de ijsemmer door haar achterpoot om te voorkomen dat te knijpen en plaats deze in de dissectie pan.
- Verwijder de klauwen eerst door te draaien ieder een naar binnen. Verwijder vervolgens iedere poot met dezelfde draaiende beweging.
- Met behulp van de rongeurs, verwijder de bovenkaak voor de mond. Verwijder ook de zachte maxillule.
- Met behulp van de rongeurs opnieuw beginnen vanaf de laterale achterste einde van de schaal en krijgen een goede grip op de rand van het. Klem naar beneden met de rongeurs en breken dat stukje schild uit te schakelen. Zorg ervoor dat u genoeg van de schaal te verwijderen, zodat de spatel om de opening te gaan. Ga door het verwijderen van de rand van de schaal tot aan de ogen en herhaal aan de andere kant.
- Met de conische kant van de spatel voorzichtig weg te schrapen de zachte binnenkant weefsel van het dak van de dorsale schild. Houd de spatel in contact met het schild om te voorkomen dat schade aan de STNS. Gebruik de rongeurs te breken weg de delen van het schild die zijn gescheiden van het weefsel. Ook aparte deel van het zachte weefsel van de ventrale schild en zorg ervoor dat alle adductoren het bevestigen van de weefsel om het schild te scheiden.
- Vakantie, weg van de dorsale schild zo ver posterior als het hart, waar er twee kleine gehoorbeentjes uitsteekt uit het schild. Snijd zo ver anterior mogelijk te maken. Stabiliseren van de Cephalon (het "gezicht") met een vinger, terwijl het doorbreken van de meest voorste delen van de dorsale schild.
- Aan de ventrale zijde van de schaal, trek het kaken een voor een door het verankeren van de rongeurs op een onderkaak, draaien ze naar buiten met de onderkaak los van de bijgevoegde epistome, en trekken weg. Twee lange gehoorbeentjes met spieren moet worden gehecht aan de geëxtraheerde onderkaak indien goed gedaan.
- Aparte weg het weefsel van de zijkanten van de cephalon de buurt van de ogen met behulp van de spatel. Met kleine dissectie schaar, dwars door het weefsel zo dicht mogelijk bij de nok van het beentje als mogelijk laag voor laag.
- Rest de krab tegen een muur van de dissectie pan en prop het op vastzetten op zijn plaats (de klauwen kan worden gebruikt voor deze). Snijd de labrum ("upper lip") uit de buurt van de epistome om zeker niet te verlaten elk weefsel bevestigd. Met behulp van bot-cutting schaar maken twee diagonale sneden in de ventrale schild om de cephalon te verwijderen.
- Neem het labrum met getande tang en snijd het labium ("onderlip") van de beentje op de buikzijde. Dan voorzichtig til de lip van de resterende ventrale schild. Gebruik de kleine schaar om het ventrale deel van de maag te scheiden van het weefsel voering het schild. Wanneer de pyloric ampullen zichtbaar zijn, snijd de maag weg van het weefsel aan weerszijden van het tot de maag wordt gewonnen uit de krab.
- Nog steeds de maag door de lip met een tang, rust de maag tegen de palm van de hand en zout in de mond giet. Dit vergroot de maag en maakt het gemakkelijker open te snijden. Gesneden uit de opening bij de mond naar beneden tussen de pylorus dwars door het beentje tussen de ampullen. Vervolgens schuin naar beneden dwars door de twee cardiale takken. Snijd de uiteinden van de drie tanden binnenkant van de maag.
- Plaats de maag op een groot, zwart, Sylgard-gecoate schaal met de binnenkant van de maag naar beneden. Vastpinnen de vijf hoeken van de voorbereiding met insect pinnen en vul de schotel met koude zoutoplossing, dompelen de hele voorbereiding (zie figuur 1).
2. Fijn Dissection
- , Micro-dissectie-instrumenten zijn nodig voor de fijne dissectie. In het bijzonder, tangen en de lente schaar gesteld en moet er een pin houder met een wolfraam naald. Een heldere, Sylgard-coating, petrischaaltje en wat fijne draden pinnen moet ook zijn voorbereid.
- Begin op de laagste vergroting, beginnen met spelden de klep helemaal dicht bij de rand die wordt gebruikt om de mondopening zijn. De volgorde van de rest van de pinnen om de voorbereiding van strak en alle andere gebieden nodig pin.
- Til de gevlekte hypodermis die het onderste deel van de voorbereiding en trim het over het verlaten van een patch van de hypodermis met twee witte stippen.
- Schil van de gele, piekerig, membraneuze weefsel buurt van de onderkant van het preparaat. De mvns zijn zwak aan de onderkant van dit weefsel. Haal voorzichtig het mvns van het gele weefsel als het is opgetrokken. Volg de gele weefsel op en snijd langs de hersenen.
- Volg de dikke processen het verlaten van de hersenen die zich uitstrekken laterally. Dit zijn de commisural zenuwen. Zodra het einde van de commissural zenuw is bereikt, verwijder dan de massa van de sponsachtige, gebroken witte weefsel dat is weg van de kant van de hersenen snijden.
- Waar de ionen en zonen de tandwielen te voldoen, weggesneden van de spieren en weefsel op de lengte van de ionen en zonen te onthullen.
- Keer terug naar de gevlekte hypodermis patch en knip het uit. Dit moet vertrekken een opening in de slagader rond de STG. Knip de opening naar de twee spieren die flank van de STG te scheiden. Til de uiteinden van deze spieren en dwars onder hen te scheiden van de slagader en naar de alns en AGNs bloot te leggen. Scheid de flankerende spieren zo ver als het kraakbeen ligt boven de stn.
- Knip de arteriële weefsel rondom de STG naar beneden tot waar de mvns, DGN, en dvn ontmoeten. Het werk neer de dvn aan de lvns en snijd door de witachtige, delicate weefsel voor de lvns.
- Zoek de PSN beentje over de aan de onderkant van de voorbereiding. De PSN kan worden gebruikt om de lvn en dlvn knooppunt te vinden.
- Vervolgens de dlvn naar de pyn en PDN vinden. De pyn wraps vaak over de pyloris ampulla naar de opening. Het PDN vorken off van het dlvn en is tussen de pyloris ampulla en de cardio pyloric klep spieren. Laat wat spieren aan een van deze zenuwen, omdat ze gemakkelijk kunnen worden verward wanneer het preparaat wordt overgebracht naar de duidelijke Sylgard schotel.
- Wanneer alle van de zenuwen zijn blootgelegd, verbreken de resterende verbindingen tussen de STNS en het weefsel en ongewenste zenuwen van de maag. Ga voorzichtig de STNS weg van de rest van de maag, het snijden elke gemiste aansluitingen.
- De toestand van de duidelijke Sylgard schotel met de overgebleven massa van de maag weefsel door te wrijven over het oppervlak van de Sylgard totdat de Sylgard niet meer voelt zich te plakkerig of droog. Sylgard is hydrofoob en de STNS zal sterk hechten aan het als de Sylgard-gecoate schaal is niet geconditioneerd op deze manier.
- Voeg wat koude zoutoplossing aan het gerecht. Pak de bovenste uiteinden van de zenuwen commissural met een tang en breng de STNS de duidelijke Sylgard schotel.
- Speld de STNS neer op de Sylgard. Scheiden de hersenen van de commissural zenuwen en gebruik de minuten pinnen aan de vier uiteinden van de tandwielen veilig naar beneden de eerste plaats. Zorg ervoor dat de voorbereiding goed is kant naar boven door te controleren of het IVN omhoog wijst weg van de Sylgard. De dgn moet een beetje af te sluiten onder de STG wanneer de STG is juiste kant naar boven. Speld de rest van de zenuwuiteinden naar beneden met de fijne draad pinnen.
- Schone weg alle resterende spier of weefsel van de STNS.
- Desheath de STG met behulp van een pen houder en een beetje verslaafd, fijne, wolfraam naald. Maak een klein gaatje in een hoek van de STG schede uit de buurt van de cellichamen en gebruik dat gat te krijgen tussen de lagen van de schede. Snijd voorzichtig een flap van gescheiden schede om de STG neuropil en cellichamen bloot te leggen.
- Beneden een pin flappen van schede om de toegankelijkheid te verhogen om de cellichamen en de STG voor intracellulaire opnames te stabiliseren. Re-pin de rest van de STNS ervoor te zorgen dat elke zenuw strak is en goed verdeeld voor de extracellulaire opname (zie figuur 3).
3. Resultaten
- Idealiter zouden alle van de zenuwen vrij zijn van inkepingen en schade, met name degenen die zullen worden opgenomen van. Geen van de zenuwen moet worden verward of gedraaid. De STG moet intact met alle van de cellen die in een baard formatie rond de neuropil. De intacte STNS is bilateraal symmetrisch en ziet eruit als een homunculus met de lvns als de benen, de mvns als de armen en het voorste einde als het hoofd.
Afkortingen:
| STNS | Stomatogastric zenuwstelsel |
| STG | Stomatogastric ganglion |
| Cog | Commissural ganglion |
| OG | Oesofageale ganglion |
| mvn | Mediane zenuw ventriculaire |
| ion | Inferior oesofageale zenuw |
| zoon | Superior oesofageale zenuw |
| AGN | Anterior maag zenuw |
| ALN | Anterior laterale zenuw |
| dgn | Dorsale maag zenuw |
| dvn | Dorsale zenuw ventriculaire |
| lvn | Laterale ventrikel zenuw |
| PSN | Posterior maag zenuw |
| pyn | Pylorus zenuw |
| PDN | Pylorus dilatator zenuw |
| dlvn | Dorsale tak van de laterale ventrikel zenuw |
| IVN | Inferior ventriculaire zenuw |
Figuur 1: Diagram van de benaderende plaatsing van de STNS in de maag voorafgaand aan de dissectie.
Figuur 2: Schematische weergave van de verschillende spieren in het onderste deel van de maag en een overlay van de STNS in het licht groen. Elke cel type in de STG is opgenomen met de spieren ze bekend zijn innerveren. Deze kaart is handig bij het plannen van een zenuw die een signaal van een bepaalde cel (met dank aan de Nadim lab) draagt ontleden.
Figuur 3: Schematische weergave van de STNS met intracellulaire elektroden en extracellulaire putten (van Marder en Bucher, 2007).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De STNS dissectie is de eerste stap in het uitvoeren van een elektrofysiologie of immunohistochemie experiment, of voor het verkrijgen van cellen voor celcultuur. Ongeacht de beoogde experiment, zal de bruto dissectie blijven ongewijzigd. Echter, de fijne dissectie variëren. Het is belangrijk om van tevoren te plannen welke cellen en welke zenuwen je zult opnemen. De meeste neuronen in de STG hebben processen die ten minste een spier innerveren in de maag (zie figuur 2) en zijn ingedeeld volgens hun geïnnerveerd doel. Daarom zijn extracellulaire registraties nodig zijn om volledig te controleren of de identiteit van een cel die intracellulair wordt opgenomen. Van de pylorus ritme van de frequentie en de robuustheid worden gebruikt om de gezondheid van de voorbereiding monitor. Daarom hebben veel experimenten zijn extracellulaire opnames van de LVN. De DGN wordt vaak gebruikt om de maag ritme te controleren. De stn is vaak cruciaal voor de meeste experimenten omdat er veel modulerende cellen in het voorste einde van de STNS en verbreken van die zenuw kan leiden tot de pylorus en het maag-ritmes tot stopzetting of onregelmatig.
Hoewel de volgorde waarin de stappen in de goede dissectie worden gedaan is niet belangrijk, we vinden het makkelijker om de STNS te verwijderen zonder schade door het houden van de uiteinden van de perifere zenuwen verankerd aan de spieren tot na de STG is losgekoppeld van de omgeving weefsel. Dit houdt de STG en STN strak genoeg om veilig en gemakkelijk verwijderen van de spieren en weefsel rond hen.
Als de voorbereiding is in de heldere Sylgard gerecht moet elk weefsel dat blijft op het STNS worden verwijderd om de interferentie met de elektroden te vermijden tijdens een experiment. Het is ook makkelijker om een goede, stabiele opnames krijgen wanneer de bereiding wordt vastgepind zo strak mogelijk zonder schade aan de zenuwen. Het is vooral belangrijk dat de STG worden vastgepind veilig door de alns met korte pinnen om de intracellulaire elektroden toegang te geven tot zoveel cellen mogelijk te maken. Het is beter om te ontleden uit ten minste een deel van een van de zenuwen die afkomstig zijn van de STG zelfs als die zenuwen niet nodig zijn voor opname. Ze kunnen zorgen voor extra ankers verdere stabilisatie van de STG op de schotel. Het is het beste te houden tamelijk kort voor maximale ondersteuning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij dankbaar erkennen de leden van de Marder Lab. Wij danken onze adviseur, dr. Eva Marder, voor haar steun en aanmoediging. Dit onderzoek werd ondersteund door het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke subsidies NS-17813 en de NS-058110.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Black Sylgard 170 | Other | Dow Corning | 170 | Gross Dissection |
| Fine Scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Insect Pins size 6 | Surgery | Fine Science Tools | 26000-65 | |
| Mayo Scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14110-17 | |
| Micro-Spatula | Surgery | WARD’s Natural Science | 15 V 4313 | |
| Rongeurs | Surgery | Fine Science Tools | 16000-14 | |
| Tissue Forceps | Surgery | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| Fine Tungsten Wire (0.001 in. diameter) | Surgery | California Fine Wire Company | Fine Dissection | |
| Forceps #5 | Surgery | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Minuten Pins | Surgery | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Moria Spring Scissors (7mm blades) | Surgery | Fine Science Tools | 15370-52 | |
| Petri Dish (100x15mm) | Other | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Pin Holder | Surgery | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Super fine forceps #5SF | Surgery | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Sylgard 182 | Other | Dow Corning | 182 | |
| Tungsten Needles | Surgery | Fine Science Tools | 10130-05 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Wild | MC3 | Misc. |
| Jonah Crab (C. borealis) | Animal | Commercial Lobster |
References
- Harris-Warrick, R. M., Marder, E., Selverston, A. I., Moulins, M. Dynamic Biological Networks: The stomatogastric nervous system. , MIT Press. Boston. (1992).
- Marder, E., Bucher, D. Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs. Annu. Rev. Physiol. 69, 291-316 (2007).
- Maynard, D. M., Dando, M. R. The structure of the stomatogastric neuromuscular system in Callinectes sapidus, Homarus Americanus and Panulirus argus (Decapoda crustacean). Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 268 (892), 161-220 (1974).
- Selverston, A. I., Russell, D. F., Miller, J. P. The Stomatogastric Nervous System: Structure and function of a small neural network. Prog. Neurobiology. 7, 215-290 (1976).
