Gross och Fine dissekering av Inner Ear Sensorisk epitel i Vuxen Zebrafish ( Danio rerio)

Summary

Innerörat sensoriska epitelet av vuxna zebrafisk är en bra modell för att förstå de mekanismer av hår cellförnyelsen i vuxen ryggradsdjur. Detta protokoll visar fina dissekering av epitel, genom vilken vi kan få vävnadsprover för att studera regenerativ händelserna på cellulär och subcellulära nivåer.

Abstract

Neurosensoriska epitel i innerörat är de avgörande strukturer för hörsel och balans funktioner. Därför är det viktigt att förstå den cellulära och molekylära funktioner i epitel, som huvudsakligen består av två typer av celler: hårceller (HCS) och stödjande celler (SCS). Här har vi väljer att studera i innerörat sensoriska epitel hos vuxna zebrafisk inte bara för att de epiteliala strukturer är starkt konservativa i alla studerade ryggradsdjur, men också för att den vuxna zebrafisk kan regenerera HC, en förmåga som däggdjur förlorar strax efter födseln. Vi använder innerörat hos vuxna zebrafisk som modellsystem för att studera mekanismerna bakom innerörat HC förnyelse i vuxen ryggradsdjur som kan vara till hjälp för klinisk behandling av hörsel / balans underskott i mänskligt som ett resultat av HC förlust.

Här visar vi hur du gör grova och fina dissektioner av innerörat sensoriska epitel i vuxen zebrafisk. Bruttomarginalen dissektion tar bort vävnad som omger innerörat och är till hjälp för att förbereda vävnadssnitt, som tillåter oss att undersöka den närmare strukturen i sensoriska epitel. Den fina dissektion rensar upp den icke-sensoriska-epitelvävnader för varje enskild epitel och ger oss möjlighet att undersöka heterogenitet av hela epitelet lätt i hela montering epiteliala prover.

Protocol

Del 1: Förberedelser av vävnaden Euthanize den vuxne zebrafisk med buffrad MS-222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt, 0,03%). Halshugga fisken. Skär av underkäken, placera huvudet på dissekering pad med den ventrala sidan uppåt och immobilisera vävnaden med insekt stift. Ta bort den mjuka vävnaden ventrala till skallen och spricka öppna den ventrala delen av skallen kapseln med ett par fina pincett under en dissektion mikroskop. Fäst fisken huvudet i paraformaldehyd (4%…

Discussion

I detta protokoll beskrivs vi de grova och fina dissekering av innerörat sensoriska epitel av vuxna zebrafisk, vilket gör att vi kan förbereda vävnadsprov för att studera de cellulära och subcellulära funktioner i sensoriska epitel.

För att kunna genomföra en framgångsrik dissektion, det allra första steget, fixering, är mycket viktigt. Se till att du alltid använder nygjord paraformaldehyd lösning eftersom gamla lösningen kommer att resultera i under-fixeringen av vävnader s…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)	Reagent	Sigma	A5040
PBS (Phosphate-buffered Saline, 10X)	Reagent	Mediatech	46-013-CM
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma	P-6148
Triton X-100	Reagent	Sigma	T8787
Alexa Fluor 488 phalloidin	Reagent	Invitrogen	A12379
VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI	Reagent	Vector Laboratories	H-1500
Dissection microscope	Microscope	Nikon	SMZ1000
Insect pins	Tool	Fine Science Tools	26000-40
Scissors	Tool	Roboz	RS-5880
Tweezers	Tool	Roboz	RS-5045
Needle blade	Tool	Sharpoint	78-6810
Fluorescent microscope	Microscope	Zeiss	Axiovert 200M
Dissection pad	Tool	eNasco	SB07840M
Zebrafish	Animal	various	n/a