Summary
De niet-menselijke primaat is een belangrijk translationeel soort voor ons begrip van de ontwikkeling en veroudering. De anatomische organisatie van het primaat netvlies kan leveren belangrijke inzichten in normale en pathologische omstandigheden bij de mens.
Abstract
Het visuele systeem bij de mens wordt beschouwd als de poort naar de wereld en speelt een belangrijke rol in de overvloed van zintuiglijke, perceptuele en cognitieve processen. Het is dan ook niet verwonderlijk dat de kwaliteit van het zicht is gebonden aan de kwaliteit van leven. Ondanks de wijdverspreide klinisch en fundamenteel onderzoek rond de oorzaken van visuele stoornissen, vele vormen van visuele beperkingen, zoals retinitis pigmentosa en maculaire degeneratie, gebrek aan effectieve behandelingen. Niet-menselijke primaten hebben het dichtst algemene kenmerken van het oog de ontwikkeling aan die van de mens. Niet alleen hebben ze een vergelijkbare vasculaire anatomie, maar onder andere zoogdieren, primaten hebben de unieke eigenschap van het hebben van een gebied in de temporale retina gespecialiseerd is voor een hoge gezichtsscherpte, de fovea
Protocol
Deel 1: Pre-verwerking van weefsel
- Weefsel moet goed worden geperfuseerd met paraformaldehyde, glutaaraldehyde, of formaline. Dit kan worden bereikt door middel van standaard transcardial perfusie meestal gebruikt om andere organen te oogsten. Het wordt aanbevolen dat kort na het offer van de ogen worden geïnjecteerd met een fixatief net onder de lens en opgeslagen in fixeermiddel.
- In de huidige studie het onderwerp was diep gesedeerd met ketamine hydrochloride (10 mg / kg, im), gedood met een overdosis natrium pentobarbital (25 mg / kg, iv) en perfusie transcardially met 0,1 M PBS tot het volledig exsanguinated. Dit wordt gevolgd door een 4% paraformaldehyde oplossing in PBS gedurende 5 minuten (~ 1 liter).
Deel 2: Het verwijderen van de oogbol uit de orbitale holte
- Voor gemakkelijker toegang tot de oogbol is het aanbevolen om eerst te verwijderen van de hersenen. Zodra de hersenen is verwijderd van de dunwandige baan bot is duidelijk zichtbaar. Gebruik het bot rongeurs langzaam chip weg de wand van de baan. Knip de oogspieren met een scalpel en verwijder het bindweefsel van de oogbol. Knip voorzichtig de oogzenuw, kan dit worden gebruikt in elektronische microscopie studies. De oogbol moet nu worden vrijgesteld van de orbitale holte.
Deel 3: Prepareer het netvlies van de oogschelp
- Plaats het oog in een petrischaal met PBS om het netvlies te houden van drogen. Een dissectiemicroscoop of tafel bevestigd vergrootglas licht stand bruikbaar is in de ontleding, maar niet een noodzaak. Verwijder het hoornvlies door het snijden van de sclera nauw samen om de omtrek van het hoornvlies op het niveau van de ora serrata met een paar van de lente schaar en verwijder de lens met de tang.
- Gebruik een penseel, tang, schaar en de lente aan het netvlies te verwijderen uit de sclera. Dit wordt gedaan door het scheiden van het netvlies van de sclera en dan snijden van de sclera weg met de schaar. Men moet het uitvoeren van dit proces in kleine stappen, zodat er geen schade of scheuren de retinale weefsel. De sclera is niet gemakkelijk gescheiden van de rest oogzenuw zo zorgvuldig de sclera rondom de oogzenuw te snijden.
- Op dit punt het netvlies heeft zijn gebogen vorm en moet worden afgevlakt voor de bemonstering. Voor afvlakking het netvlies, kan het glasachtig lichaam, waardoor de consistentie van gelei heeft, verwijderd worden in een keer. Te vlakken het netvlies op een dia, maken een aantal radiale snijdt met een scalpel. De resterende glasvocht kan nu worden verwijderd met gewone filter papier en een penseel. De retinale ganglion cel laag wordt blootgesteld op dit punt dus het is noodzakelijk om zacht bij het verwijderen van het glasvocht. Als de oogzenuw is nog steeds verbonden aan de optische schijf, verwijder de optische zenuw, zonder het rippen van het netvlies met behulp van een scalpel en een paar van de lente schaar. Dit is nu een platte berg netvlies (figuur 1) en de fovea moet duidelijk zijn als een donkere vlek in de temporale / ventrale richting van de optische schijf.
Deel 4: Monsterneming
- Er zijn een aantal opties voor de bemonstering van de retina. Hier beschrijven we de flatmount voorbereiding en isodentric bemonstering. Voor beide procedures flatmount het netvlies met de optische vezel laag uit de buurt van de dia. Als het de bedoeling is te onderzoeken of het retinale ganglion cel laag in de flatmount voorbereiding, is het noodzakelijk om ofwel te verwijderen of bleek de gepigmenteerde epitheel. Voor het verwijderen van de gepigmenteerde epitheel licht gebruik maken van een penseel om een aantal van deze laag te verwijderen, deze heeft de neiging om schade aan de afdrukband laag. Bleken gaat het weken het netvlies in kaliumpermanganaat-oplossing (0,25%) voor een uur, wassen in gedestilleerd water, en de open plek in oxaalzuur (5%) gedurende 5 minuten 2.
- Als het de bedoeling is te onderzoeken cel distributie en de morfologie van elke laag in heel het netvlies, dan raden we isometrische bemonstering van het netvlies. Het netvlies moet flatmounted op een dia en vochtig gehouden met PBS. Voor de isometrische monsters gesneden kleine stukjes weefsel op gelijke afstand van de optische schijf in de neus, temporele, bovenste en onderste richtingen (Figuur 1). Het is niet nodig voor het bleken van de gepigmenteerde epitheel in dit preparaat. Deze stukken kunnen nu doorsnede worden in het frontale vlak met een cryostaat, vibratome of ultramicrotoom afhankelijk van de onderzoeksvraag. Voor de cryostaat snijden, moeten de stukken worden cryoprotected in 30% sucrose 's nachts en bevroren in het kader van een montage medium op droog ijs. Als alternatief kunnen de monsters worden ingebed in agar en gesneden op een vibratome. De cryostaat en vibratome voorbereidingen betrouwbaar zal opleveren secties zo dun als 4 m. Als dunnere secties nodig zijn (bijvoorbeeld voor elektronenmicroscoop voorbereiding), is het noodzakelijk om de monsters voor te bereiden op de ultramicrotoom. Om dit te doen, moeten de onderdelen post-gefixeerd in osmium tetroxide gedurende 1 uur onder de fumehood. Dit wordt gevolgd door uitdroging in een ethanolreeks (50, 70, 95, 95, 100, 100%) en 100% propyleenoxide. Het weefselwordt dan ingebed in EPON (EMBED-812 inbedding kit).
Deel 5: representatieve resultaten:
In ons laboratorium hebben we routinematig immunohistochemie op cryosectioned retinae (figuur 2). In dit geval zijn we geïnteresseerd in de isodensity van de cannabinoïde-receptoren (CB1) in de retina. We onderzoeken ook het effect van prenatale blootstelling aan ethanol op het primaat visuele systeem. Daartoe zijn we geïnteresseerd in cel dichtheid en laagdikte in de fovea en in de perifere retina. Om dit te bereiken, hebben we stukjes netvlies verankeren in Epon, slice op 700nm op een ultramicrotoom, en vlek met 1% toluïdineblauw (figuur 3).
Figuur 1 Flatmount Retina. Radial bezuinigingen worden gebruikt om het netvlies af te vlakken.
Figuur 2 Immunokleuring. Cryosection van de perifere retina immunostained voor CB1, waar de retinale ganglioncellen zwaar zijn gelabeld met een aantal etikettering in de binnenste en buitenste nucleaire lagen. De dikte van dit onderdeel is 14 m en gekleurd op de dia. RG - retinale ganglion laag; IP - binnenste plexiform laag; IN - binnenste nucleaire laag; OP - buitenste plexiform laag; ON - buitenste nucleaire laag.
Figuur 3 Fovea. Doorsnede van de fovea, dat was ingebed in EPON en gesneden op een ultramicrotrome bij 700nm. De afdrukband laag (PR) werd gebruikt om de secties uit te lijnen. Merk op dat de volledige omvang van de fotoreceptoren kunnen worden geïdentificeerd met de bijbehorende hoek in het frontale vlak. Dichtheid van metingen werden genomen op 300 m, 500 m en 800 m van het centrum van de foveale put met behulp van de Bioquant Imaging systeem.
RG - retinale ganglion laag; IP - binnenste plexiform laag; IN - binnenste nucleaire laag; OP - buitenste plexiform laag; ON - buitenste nucleaire laag; schaal bar = 50 m
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De voorbereiding van het netvlies als een wholemount maakt voor de analyse van de topografie en de ruimtelijke verdeling van ofwel het ganglion cel laag of de endotheliale cellen van het netvlies bloedvaten 3. Kwantificering van de celdichtheid in de periferie van de retina wordt eenvoudig volbracht. Echter, in perifoveal en foveale regio's, de stapeling van meerdere lagen in het ganglion cellaag belemmert kwantificering. Om dit te omzeilen mogelijke vertekening, kan de fovea en perifoveal regio ontleed uit de wholemount voorbereiding, ingebed in Epon, en serieel coupes met behulp van een ultramicrotoom om semi-dunne secties te verkrijgen in het frontale vlak 2,4. Er zijn een aantal andere nadelen aan de wholemount voorbereiding, die kan worden overwonnen met alternatieve bemonstering paradigma's.
Het nemen van monsters van isometrische het netvlies en snijden in het frontale vlak op ofwel een cryostaat of vibratome zorgt voor specifiek onderzoek van de verschillende lagen, die niet gemakkelijk kunnen worden uitgevoerd op een wholemount voorbereiding. Snijden op deze manier maakt het ook mogelijk voor de toepassing van meerdere immnohistochemistry protocollen 5. Deze secties kunnen vervolgens worden verwijderd van de glijbaan, ingebed in Epon en gesneden op een ultramicrotoom. Met een ultramicrotoom kleine wijzigingen in de snijhoek kan worden gemaakt met een standaard frontale vlak te waarborgen door de fotoreceptoren. Zodra een standaard vliegtuig is verkregen, kan laagdikte worden gemeten en vergeleken tussen het netvlies regio's en onderwerpen. Bovendien kan Epon ingebed weefsel worden gebruikt in elektronenmicroscopie studies om ultrastructurele kenmerken van het netvlies 6 onthullen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Ikiel Ptito bedanken voor zijn technische ondersteuning. We zijn dankbaar voor Frank Ervin, Roberta Palmour en het personeel van Gedragswetenschappen Stichting Laboratoria gevestigd in St. Kitts, West-Indië, voor hun blijvende steun van onze primaat werk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15020-15 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | Any surgical scissors are sufficient |
| Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-924-150 | |
| Camel or Sable Hair paintbrush | Any Supplier |
References
- Hendrickson, A., Kupfer, C. The histogenesis of the fovea in the macaque monkey. Invest Ophthalmol Vis Sci. 15, 746-756 (1976).
- Herbin, M., Boire, D., Ptito, M. Size and distribution of retinal ganglion cells in the St. Kitts green monkey (Cercopithecus aethiops sabeus). J Comp Neurol. 383, 459-472 (1997).
- Stone, J. The Wholemount Handbook. , Maitland Publishing Pty. Ltd. Sydney. (1981).
- Herbin, M., Boire, D., Theoret, H., Ptito, M. Transneuronal degeneration of retinal ganglion cells in early hemispherectomized monkeys. Neuroreport. 10, 1447-1452 (1999).
- Krebs, W., Krebs, I. Primate Retina and Choroid Atlas of Fine Structure in Man and Monkey. , Springer-Verlag. New York. (1991).
- Pow, D., Sullivan, R. Nuclear kinesis, neurite sprouting and abnormal axonal projections of cone photoreceptors in the aged and AMD-afflicted human retina. Exp Eye Res. 84, 850-857 (2007).
