Summary
このビデオでは、アメリカカブトガニと網膜電図記録、視神経の記録、および網膜内記録を行う
Abstract
アメリカカブトガニ、 カブトガニポリフェムスは地球上で最古の生き物の一つであり、動物は生物医学研究に不可欠な役割を果たしている。だけでなく、彼らの血は、科学者が当社の医薬品でbacteriotoxinsを検出するために使用する特殊な細胞が含まれていますが、彼らの目はまた、明順応や側方抑制のような私たちの視覚システムで動作している生理的過程、について多くの洞察を提供している神経回路網が含まれていません。カブトガニは、動物が大型と無脊椎動物のための丈夫なので、その網膜の神経細胞が大きく、簡単にアクセス可能なビジョンの研究のための魅力的なモデルのまま、その視覚的なシステムは、コンパクトで広く研究されている、とその視覚的な動作は明確に定義されています。また、眼の構造と機能は、動物の脳の体内時計によって日常的に変調されています。一言で言えば、カブトガニの視覚システムは、興味深いものにするために十分な複雑なまだ理解できるほど簡単です。
このビデオでは、カブトガニとin vivoで行うことができるビジョンの神経基盤を調べるための3つの電気生理学的パラダイムを提示する。彼らは、網膜電図記録、視神経の記録、および網膜内記録です。表面と網膜電図（ERG）の記録測定は、光の点滅に眼内のすべてのセルの合計電気的応答を電極。彼らは時間の期間を延ばすために目の全体的な感度を監視するために使用することができます。視神経の録音は、細胞外microsuction電極を有する単一の神経線維のスパイク活動を測定する。彼らは、眼から脳だけでなく、脳から目にフィードバック概クロックメッセージを伝える視覚的メッセージを研究するために使用することができます。網膜内の録音は、細胞内微小電極と眼の個々の細胞で光によって誘起される電圧変動を測定する。それらは網膜処理の細胞メカニズムを解明するために使用することができます。
Protocol
その1：実験の準備
カブトガニで行わ実験手順は、ボストン大学の動物実験使用の委員会によって承認されている。動物は規制の明暗サイクルにさらされた部屋で海洋生物学研究所（ウッズホール、マサチューセッツ州）または他のベンダーから購入し、通気海水槽に収容されています。照明のレジメンは、カニの体内時計を同調し、その日中および夜間の状態の間、毎日目を入れ直すために重要である。直ちに侵襲的処置を開始する前にその動きを遅くして、前体部とopisthosomaの2つに挿入された2つのステンレス製ビスを木製の台に固定されるまで、動物は10〜15分間氷のバケツで冷却される。それが水に沈むように、プラットフォームは花崗岩で下に重み付けされます。ターミナル実験の後、動物は再び氷スラリーに浸漬し、メスで、口の上にある脳を、ピッシングにより安楽死されています。
パート2：ソリューション
カブトガニリンゲル溶液は430 mMのNaCl、9.56 mMの塩化カリウム、9.52 mMの塩化カルシウム、9.97 mMのMgCl 2、21.05 mMの硫酸マグネシウム、50μMTES、50μMHEPES、および10ミリリットル/ Lペン-球菌ミックス（ペニシリン - ストレプトマイシン、10000単位/ ml）で構成されています。
パート3：網膜電図記録
この手順に必要な工具はプラスドライバー、ワセリン、リンゲル溶液、転送ピペット、緑色LED、録音室、ステンレス鋼製ねじ、と綿棒が含まれています。
- 手作りのチャンバーは、ERG（図1A）を記録するために使用されます。チャンバ本体は、眼に接触して生理食塩水タンクを保持するために設計されています。蓋にはLEDを収容できるサイズにアンプと小さな穴に導電性溶液を結合するための塩化銀のワイヤーが含まれています。 520nm付近のピーク発光を有するLED超高輝度が最適に動作します。
- 起動するには、チャンバーの下側は、石油ゼリーでコーティングし、2本のネジで眼を介して固定されています。
- チャンバーは、生理食塩水を充填し、蓋で覆われている。
- チャンバーの添付ファイルの後にカニは鰓以上海水で満たされたタンクの遮光ケージに入れています。
- LEDケーブルをチャンバーの蓋に挿入されます。
- 信号リードは、塩化線にクリップされており、基準リードを注入ネジの1つにクリップされます。
- 両方のリード線は、10Hz未満の周波数を渡すために設定されている信号の増幅とアンプのフィルタのためにハイインピーダンスの差動アンプ（X -セル3x4の、FHC社）のヘッドステージに接続されています。
- アンプの出力は、コンピュータの分析と保管のために鑑賞するためにオシロスコープとデータ集録ボードに供給されます。
- セットアップ後にケージのドアは、動物に達することから、部屋の明かりを遮断するために閉じている。
- データは、LabVIEWで記述されたカスタムプログラムで収集されます。プログラムは、LEDを点滅誘発ERG信号を記録し、ピークツーピーク応答振幅を測定します。フラッシュパラダイムの選択は、実験目的によって異なります。例えば、5Vの短い（100ミリ）パルスは、LEDへの10分ごとに視感度の概日変化を監視する際に明順応の影響を回避して適用。
パート4：視神経の記録
この手順に必要な工具はドライバー、スレッド、トレパン、リンゲル溶液、rongeurs、vannasのはさみ、録音室、曲がったピンセット、細針プローブ、鈍いメス、手術用はさみ、および吸引電極を含む。
- 手作りのチャンバーは、視神経の応答（図1B）を記録するために使用されます。チャンバーの内部には神経を収容し、周囲組織から分離するために底壁の薄い半円形の溝開口部を有する2センチメートル-直径開いてもです。
- チャンバーの添付ファイルの前に16ゲージの針が心臓にヒンジ筋肉の間に挿入され、血液の〜20ccは、動物から排出される。瀉血は必要ではありませんが、視神経の解剖が容易になります。
- 視神経の位置は、甲羅の側面と中央の目の間にわずかに曲線を描画することによって推定される。
- 円形の穴は、トレパンと甲羅にカットされます。穴は、穴のチャンバーと同じ直径です。穴の中心は側眼と神経がよくの腹部分に沿って実行されるように、ラインにわずかに背側前方に2〜3センチメートルに位置しています。
- 神経が完全に表示し、周囲組織と根底にあるから自由になるまで、結合組織はクリアされます。
- スレッドのストランドは、神経の周りにループと下部にあるスロットを通ってチャンバに取り込まれます。この同じ開口部を介して神経を穏やかに文字列を引っ張って、チャンバー内に導かれる。同時に、チャンバーはよく穴に挿入されます。チャンバーは、甲羅に貼付されていますネジと同様にリンゲル溶液で満たされている。
- チャンバーの添付ファイルの後に動物は鰓を介し海水で満たされたタンク内の遮光ケージに入れています。
- よくは、ステレオスコープ（SMZ - 168、ジェドペラ社）と綿をチャンバーの外に、生理食塩水、血液の漏出を防ぐために底の開口部の周囲にパディングされている下で可視化です。
- 神経の周り残留結合組織は、微細なハサミとピンセットで除去され、そしてチャンバーは新鮮なリンゲル液を再充填される。
- ニックネームは、神経をカプセル化し、この開口を介して神経を注意深く細かいハサミ、ピンセット、そして針プローブを用いてその長さに沿ってdesheathedている血管で作られています。
- 小さな繊維束は、求心性繊維の記録のためにと遠心性繊維の記録のための目に最も近い端の目から最も遠い端にプローブとカットを使用して、神経から分離されている。ビデオでの求心性繊維の記録のための端がカットされます。
- リンガー液で満たされたmicrosuction電極（AMシステムズ社）は、視神経のレコーディングに使用されます。電極の先端は、キャピラリー直径1mmのホウケイ酸ガラスの端を研磨火災による神経束に取り付けられています。
- 電極の先端を手動マニピュレーター（WPI社）とウェルチャンバーに低下し、カットの繊維束は、先端に吸い込まれる。吸引は、チューブを介して電極に接続さGilmontの注射器によって提供されます。
- BNC接続は、信号リードを提供し、ノイズを低減するために電極に巻き付け塩化銀線は、基準リードを提供します。 2本のリード線は、信号増幅やノイズフィルタ（X -セル3x4の、FHC社）用の差動アンプのヘッドステージに接続されています。アンプの出力は、コンピュータの分析と保管のための表示とデータ集録カード用オシロスコープに送信されます。
- データは、LabVIEWで記述されたカスタムプログラムで収集されます。プログラムは、デジタルビデオプロセッサを介して光の刺激を制御する（ビット+ +、ケンブリッジリサーチシステムズ社）とスパイクを記録するデジタルスパイク弁別器（APM、FHC社）とのインターフェイス。光は、コンピューター制御のビデオディスプレイを介して光ファイバライトパイプを介して、または全体の目には目の中に単一の細胞に送達することができます。
パート5：網膜内記録
この手順に必要な工具はドライバー、ネジのネジ穴とL字型のルーサイトのプラットフォーム、ガラスピペットを用いて微小電極ホルダー、ステンレス鋼製ねじ、ピンセット、そして素晴らしいメスが含まれています。
- プリセットネジ穴と手作りルーサイトのプレートは、細胞内応答を記録するために使用されます。穴は電動マイクロマニピュレーター（PPM5000、WPI社）を取り付けるために離間している。プレートは2つの側面のネジと上部に1つで動物に添付されます。
- プレートの付着した後、動物は、鰓を介し海水で満たされたタンク内の遮光ケージに入れています。
- micropositionerは眼を介して合わせながら、可動アームで、プレートにねじ込まれている。
- ガラスのマイクロピペットのバッチは、1 mmのODホウケイ酸ガラスから引き出されているとヒントは、3M KCl溶液の小さいバイアルにピペットを配置することにより、毛細管現象を介して充填されています。
- ピペットの残りは、塩溶液を使用して手動で充填し、電極ホルダに挿入されます。
- 電極ホルダーはmicropositionerアームに固定された細胞内のアンプのヘッドステージ（IR - 283、シグナステクノロジー株式会社）に接続されています。
- 網膜の小さなセクション（〜1平方ミリメートル）はカミソリの刃で角膜のインタフェースを離れて切断することによって公開されます。
- リンゲル溶液の液滴が乾燥し、マイクロピペットの先端が網膜組織への開口部を通って進められるのを防ぐために露出網膜上に配置されます。
- 先端が溶液に入ると、細胞内のアンプの電流注入モードが係合され、電極インピーダンスを測定する。 20から70 MWの範囲外のインピーダンスを持つマイクロピペットは破棄されます。この範囲内のものは、ミクロンステップで進んでおり、電子的または機械的にピペットの先端を振動させて細胞内にimpaledされています。
- 細胞の3種類の眼に発生する可能性があります。 Retinular細胞が光にのみ脱分極応答を示し、偏心細胞は脱分極応答に乗って活動電位の列車を示し、色素細胞は、まったく光の応答を示していない。
- データは、LabVIEWで記述されたカスタムプログラムで収集されます。プログラムは、デジタルビデオプロセッサ（ビット+ +、ケンブリッジリサーチシステム）を経由して光刺激を制御します。刺激は、光ファイバーパイプまたはビデオディスプレイとimpaled細胞に送達されています。電圧の応答は、オシロスコープで観察し、コンピュータにプログラムによってデジタル化されています。
パート6：代表的な結果
代表的なERGは、図2Aに示されています。波形は、合計の電気を表します主に受光retinular細胞の光に反応し、彼らは非常にエキセントリックな細胞数を上回ると電気的にそれらに結合される。哺乳類のERGと同じように別の網膜細胞型から複数の波形成分が不足しています。カブトガニの脳内の時計から概日フィードバックは、時間（1）の経過とともに変化するERGの振幅と時間の経過を引き起こし、日常的に網膜細胞の生理学的特性を調節する。図2Bに示すように、ERGの振幅は主観的な日中は動物の主観的な夜と最低の時に最高です。
光への単一の視神経線維の応答の代表的なトレースを図3に示されています。エキセントリックな細胞は、すべての持続的なレベルに減衰が続くスパイクの吐出量の一過性増加を示し、ほぼ同じように動作します。速度の減衰は、偏心細胞（2）で明順応とスパイクに依存する自己阻害の複合作用を反映している。このような速度での光依存性の減少など、他のスパイクパターンは、カブトガニの脳ではなく目（3）で見られている。
光への色素細胞、retinular細胞、および偏心セルの電圧応答の代表的なトレースを図4に示されています。だけ後者の二つの網膜細胞の種類は視覚的です。彼らの応答の振幅と時間の経過は、記録の質と細胞内の電極の位置によって異なります。通常、電極は、サイズが大きいためと数字の色素細胞やretinular細胞を貫通している。後者の、持続的なレベルに減衰する一過性脱分極が記録されている場合。崩壊はretinular細胞による光適応（2）によるものです。電極が偏心のセルを入力した場合、大規模な活動電位は軸索（40 - 70mVの）と相馬の近くに脱分極波形（<25mVの）に乗って小さな活動電位に記録されます。
図1。網膜電図記録（A）と視神経の記録（B）に使用するチャンバーの模式図。バーは、Bのは、5mmで7ミリメートルのequals
100msの間で誘発リムルスERGの図2。トレース例では、暗闇の中で、5Vのパルス（）と一定の暗さ（B）の経時的なERG振幅のピークツーピーク変動のLED。闇は白い三角形で指定された時間に開始された。黒の三角形で示された時間を通じて、ERG振幅の成長は、暗闇の中で目の感度を増加させる光順応、によるものです。 ERG振幅の周期的な変動は、その後、動物の内部体内時計によるものです。 Bの時点では、毎5分です。
シングルommatidial受容体にフラッシュ光に視神経線維の応答の図3。トレース例。トレース上の波形は、刺激のタイミングを示します。その軸索は神経線維を生じさせる偏心細胞は、すべての実験（完全な暗闇で5秒フラッシュ）の照明条件の下でこのように焼成の類似したパターンを示しています。スパイクと網膜のコーディングは、プロパティのカブトガニは、他の脊椎動物とは異なり、哺乳類と共通しているです。
色素細胞（）、retinular細胞（B）、及び偏心セル（C）：カブトガニ側眼に存在する3種類の細胞の光に対する電圧応答の図4の例のトレース。最初のセルは非ビジュアルです。後者の二つは、光のフラッシュ時に脱分極。彼らは光を伝達し、エキセントリックな細胞にギャップ結合を介して信号を送信するため脱分極は、道に沿っていくつかの損失で、retinularセルについて最大です。偏心細胞では、軸索によってトリガーされるアクションの電位は細胞体に起因するスパイクのバックプロパゲーションへの脱分極に乗って見られている。活動電位の振幅は、脱分極性の良い表示のための図で減衰されています。細胞の静止電位が- 50mVです。
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Discussion
我々は、生体内でのカブトガニのERG記録、視神経の録音、および網膜内の録音を実行する方法を説明しました。記録技術は、それぞれのビジョンの神経基盤にさまざまな洞察を提供し、それらはすべてカニの大きな目、ハード甲羅に生きている動物のおかげで網膜機能を研究するために使用することができます。視神経の活動であっても自由に電極を適切に構築する（4）と海で動物を振る舞うから録音することができます。これらの技術はまた、セットアップのマイナーな修正で摘出された眼で行うことができます。自然条件にそのような実験の妥当性は、動物（5）から削除するときにカニの目の変化の生理学的特性として、限定されるだろうが、教育的価値は、これらのメソッドの普及で、特定の教育ラボに最適ですね神経科学。
ERG記録、視神経の記録、および網膜内の記録は、わかりやすくするために別々にここで発表されました。実際には、複数の記録方式は、しばしば同時に神経活動の変化を監視するために、単一の実験と、1つまたは両方の横の目の視感度に統合されました。我々はERGの記録に使用する小型のチャンバーは、他の設計よりもこの点に関して、（1、6）に特に有利である。また、時間をかけて乾燥させることができる、従来の芯を電極に関連付けられている安定性の問題を排除し、空気からシールされている生理食塩水の貯水池を保持しています。神経の録音について説明したのと同じ手順では、電極を接続することにより、神経刺激のために使用することができるので、カブトガニで可能な視覚実験のスイートには、代わりに信号増幅器の電気刺激装置につながる本を超えることもあります。
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Acknowledgments
著者は、このビデオの記事を生成すると彼女の助けのために博士ビルギットヴェルナーに感謝します。この研究は、NSFのキャリア賞によって資金を供給された。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| LED | Light source | Newark Inc | 33C1292 | |
| Suction electrode | Electrode | A-M Systems | 573000 | |
| XCell 3*4-Channel Extracellular Amplifier | Amplifier | FHC, Inc. | 40-40-8B | |
| Intracellular Recording | Amplifier | Cygnus | IR-283A | |
| APM | Neural Spike Discriminator | FHC, Inc. | APM | |
| Bits++ | Video Board | Cambridge Research Systems | Bits++ | |
| Piezopatch Manipulator | Micropositioner | World Precision Instruments, Inc. | PPM5000 | |
| Square Pulse Stimulator | Nerve Stimulator | Grass Technologies | Model S48 | |
| P-97 | Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | |
| Borosilicate Glass Capillary | Electrode glass | World Precision Instruments, Inc. | 1B150-4 | |
| Horsesh– crab (Limulus polyphemus) | Animal | Marine Biological Laboratories | ||
| Micropipette Puller | Glass Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Zoom Stereoscope | Microscope | Jed Pella Inc. | SMZ-168 |
References
- Barlow, R. B. Jr Circadian rhythms in the Limulus visual system. J. Neurosci. 3, 856-870 (1983).
- Passaglia, C. L., Dodge, F. A., Barlow, R. B. Cell based model of the Limulus lateral eye. J. Neurophysiol. 80, 1800-1815 (1998).
- Snodderly, D. M. Jr Processing of visual inputs by the brain of Limulus. J. Neurophysiol. 34, 588-611 (1971).
- Passaglia, C., Dodge, F., Herzog, E., Jackson, S., Barlow, R. Deciphering a neural code for vision. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 12649-12654 (1997).
- Barlow, R. B., Kaplan, E. Limulus lateral eye: properties of receptor units in the unexcised eye. Science. 174, 1027-1029 (1971).
- Bolbecker, A. R., Lewis, A. R., Swan, A. A., Carlson, K., Fleet, J. R., Beck, K. E., Wasserman, G. S. Stable Bellows Cup Electrode Demonstrates Low-frequency Properties of Long-term Electroretinographic Recordings in the Limulus Lateral Eye. J. Neurosci. Meth. 159, 252-260 (2007).
