Summary
我々は、説明
Abstract
筋ジストロフィーは、収縮筋細胞の進行性の喪失によって特徴付け変性筋疾患のグループです。現在、利用可能な治療法はありません。幹細胞生物学における最近の進歩はこれらの疾患を治療する効果的な細胞ベースの治療法の開発のための新たな希望を生成している。ジストロフィーモデル動物の筋肉への蛍光タンパク質で標識された幹細胞の様々なタイプの移植分野で広く使用されています。移植細胞の運命を追跡する機能を持つ非侵襲的方法は、長手方向に、より正確かつ効率的に移植された細胞が筋肉の生着を評価するために我々の能力をさらにすることができます。
本研究では、我々 は 、in vivo蛍光イメージングに移植GFP（緑色蛍光タンパク質）で標識したマウス骨格筋の細胞を追跡するための高感度かつ信頼性の高い方法であることを示している。蛍光タンパク質の励起に必要な外光の使用に起因するバックグラウンドについての懸念にもかかわらず、我々はどちらかヌードマウスを使用するか、この問題の多くの脱毛の試薬で髪を排除することによって排除されることがわかった。 CCDカメラを使用して、蛍光シグナルは、GFPトランスジェニックマウスまたはeGFPのが筋芽細胞の培養、形質導入のいずれかから5 × 10 5細胞を注入した後、前脛骨筋（TA）筋肉で検出することができます。このような指伸筋の筋（EDL）として、より表面的な筋肉のために、より少ない細胞の注入は、検出可能なシグナルを生成します。信号強度は、関心領域（ROI）で毎秒放出されるフォトンの数として測定して定量することができる。取得した画像が移植された領域を画定明確な境界を示しているため、ROIの大きさも同様に測定することができます。足が一貫してたびに配置されている場合、筋肉とROIの大きさごとに毎秒の光子の総数の変化は、移植細胞数の変化と移植された領域の大きさを反映している。したがって、時間をかけて、同じ筋肉の変化が定量化可能である。 生体内蛍光イメージング技術では tumorogenic細胞の成長を追跡するために主に使用されている、我々の研究は、それが移植された幹細胞の運命を追跡するために私達を可能にする強力なツールであることを示しています。
Protocol
細胞の準備
- 衛星細胞の単離
- 麻酔下で、GFPトランスジェニックマウス（C57BL / KA -βactin- EGFP）の四肢筋が削除されます。小片に切断した後、衛星細胞は37℃で1時間2％ディスパーゼのコラゲナーゼ溶液とみじん切りの組織を培養することにより酵素的に解離して℃である
- ハムのF - 10および20％FBSを含む増殖培地で酵素消化を中和する、パスツールピペットで繰り返し摩砕によって筋肉を解離する。細胞は、細胞ストレーナー（Ø70 -100μmの）を通して濾過し、次いで37℃で1時間、ノンコーティングディッシュ℃の上にメッキされています
- 静かにコラーゲンコートしたディッシュ上清とプレートそれらを削除します。筋芽細胞を浄化するために、このステップ1時間後に繰り返します。 （プレプレート）
- 時間内にメディアとプレートのセルを変更する。最終精製筋芽細胞は、37を含有する培地ハムF - 10、20％FBS、100 U / mlペニシリン、および100μg/ mlのストレプトマイシン（増殖培地）で培養されている℃、5％CO2、95％空気とC。
- 文化とは10 ng / mlの塩基性FGFの添加によって増殖培地中で一次筋芽細胞を展開します。
- in vivo実験すべてでは、TAの筋あたり5 × 10 5細胞を注入する。
- 筋芽細胞を収穫するとき、我々は、0.25％トリプシン/ EDTAを用いて細胞を剥離し、PBSで2回それらを洗う。細胞数を、血球計でカウントされ、細胞を5 × 10 4細胞/μlの濃度でHBSSに再懸濁する。 HBSSで集中細胞を氷の上に置き、収集後1時間以内に注入される。
生体内撮像
- 4-6週間の年齢で雄のmdxマウスは、ジャクソン研究所から購入し、動物飼育設備で維持されています。
- 環境への宿泊施設の約一週間後、マウスは、培養細胞を移植する準備が整いました。
- 細胞移植の前に、マウスは、ケタミン（100 mg / kg体重）及びキシラジン（10 mg / kg）の混合物の腹腔内（ip）注射による麻酔です。その後、TAの筋面積約毛が足にNairさんを適用し、それを蒸留水できれいに拭くために30秒待つことによって削除されます。
- マウスは、麻酔下に入れたまま、10μlのHBSSで5 × 10 5細胞は徐々に30ゲージの針を使用して3点でそれぞれのTAの筋肉に注入されています。
- ステップ4の後、マウスは、定期的に生体内蛍光イメージングで撮像することができます。高感度電荷結合カメラを装備した蛍光イメージング駅NightOwl LB981（Berthold社Technologies社）は、マウスの妨げに足から画像を取得するために使用されます。
- in vivoイメージングの日には、まずTAの筋で発毛を確認してください。必要に応じて、我々は、ケタミンとキシラジンの混合物で、マウスを麻酔した後、上記のような毛を削除するNairさんを再適用します。
- マウスは麻酔がかかっているとき、我々は、黒以外の蛍光紙（ストラスモアから黒Artagain紙）上に腹臥位にマウスを置きます。完全に良くイメージングのためのTA筋肉を公開するには、我々は紙に後肢をテープ。
- 我々は、イメージングチャンバーと位置、カメラの視野の中心に撮像される後肢にマウスを置きます。我々は最初の5秒間の露光時間で足の伝統的なグレースケールの写真撮影をするために発光フィルターを切り替える。マウスの位置を再調整し、必要に応じてカメラの焦点。露光時間（1,250ミリ）、試料の高さ（0.9センチ）などを含む撮像パラメータは、実験過程で一定に保たれる。
- 私たちは、その後、緑色蛍光タンパク質の波長のために適切な排出のフィルタに切り替える。我々は1,250ミリ秒と1のビニング数の露光時間で蛍光画像を取る。イメージング後、マウスは回復を待つためにケージにイメージングチャンバーから除去される。
- 分析のために、我々は、毎秒の光子の面で彼らの強度を測定する蛍光シグナルを介して関心領域（ROI）を描く。我々はまた別の定量値として画素数の点ではROIの大きさを測定する。縦断的データを取得するために、必要に応じてイメージング実験は、数か月にわたって、より頻繁に毎週繰り返すか、することができます。
実験の終了時に、マウスを安楽死されており、TAの筋は組織学の分析のために収穫される。
Discussion
我々はこの研究ではホスト骨格筋に蛍光標識された移植細胞を追跡するために信頼性と安定したイメージングプラットフォームを設定します。 GFPトランスジェニックマウスからGFP -標識筋芽細胞は、将来の細胞治療の候補となる成体幹細胞の種類を表しています。細胞数、細胞の注入、明確な背景、結像位置とマシンのパラメータを含む一定の操作は、高品質な画像を得るために、特に定量的な分析のために重要です。
蛍光イメージングは、使用する非侵襲的、容易であるので、生物医学研究における多くのアプリケーションがあり、高スループットを持っています。さらに、蛍光イメージングは、散乱、減衰と吸収のためにも、光子のカウントに基づいて定量的な測定を提供することができる、光のテクニックの欠点である組織に大きな距離を、侵入することはできません。努力は、光の侵入深さを高めるために赤や近赤外レポーターを使用するために進められている。
蛍光イメージングのもう一つの利点は、特定の蛍光レポーターが人間の使用が承認されている場合、それが診療所への翻訳であるということです。 MRI、CT、およびPETと比較して、蛍光イメージングは、高価なハードウェアおよび造影剤を必要としない高い柔軟性を備えています。一例としては、診療所で使用されている蛍光ベースの内視鏡とマイクロ内視鏡です。他のモダリティとの蛍光イメージングを組み合わせることで、我々は、基礎となる生物学的プロセスについての解剖学的および機能的な情報の両方を取得する能力を達成できる見込み。
Acknowledgments
ZヤンとY王の仕事は、NIAMS / NIHからの助成金K02 AR051181、筋ジストロフィー協会とY王のためのハーバード幹細胞研究所からの補助金によって可能となった。 Q曽とX徐の作業は、ブリガムアンドウィメンズ病院から光イメージングラボに授与されたプログラムの助成金によってサポートされています。著者らは、細胞の仕事の技術的なヘルプのために麻酔科、BWH、から温劉に感謝いたします。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NightOwl LB981 | Berthold Technologies |
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