Summary
Мы описываем
Abstract
Мышечные дистрофии в группу дегенеративных заболеваний мышц характеризуется прогрессирующей потерей сократительной мышечных клеток. В настоящее время, нет никаких лечебных лечения. Последние достижения в области биологии стволовых клеток породили новые надежды на развитие эффективных ячейке на основе терапии для лечения этих заболеваний. Трансплантация различных типов стволовых клеток, меченных флуоресцентных белков в мышцах дистрофических моделей на животных было широко используется в полевых условиях. Неинвазивный метод с возможностью отслеживать судьбу трансплантированных ячейки продольно может еще больше наша способность оценивать мышц приживления на пересаженные клетки более точно и эффективно.
В настоящем исследовании мы демонстрируем, что в естественных условиях флуоресценции является чувствительным и надежным методом для отслеживания пересаженных GFP (зеленый флуоресцентный белок)-меченых клеток у мышей скелетных мышц. Несмотря на озабоченность по поводу фон, связанный с использованием внешнего света необходимо для возбуждения флуоресцентного белка, мы обнаружили, что с помощью либо обнаженной мыши или устранение волос с реагентами удаления волос много эта проблема устранена. Использование ПЗС-камеры, флуоресцентный сигнал может быть обнаружен в передней большеберцовой (ТА) мышцы после инъекции 5 х 10 5 клеток с обеих GFP трансгенных мышей или EGFP трансдуцированных миобластов культуры. Для более поверхностные мышцы, такие как Лонга разгибателей пальцев (ДЭС), инъекции меньшее число клеток производит обнаруженный сигнал. Интенсивность сигнала может быть измерена и количественно, как число излученных фотонов в секунду в области интереса (ROI). Поскольку полученные изображения показывают четкие границы демаркации привиты области, размер возврата инвестиций могут быть измерены, а также. Если ноги расположены последовательно каждый раз, изменения в полное число фотонов в секунду на мышцы и размер рентабельности отражают изменения в количестве привитых клеток и размер привиты области. Поэтому изменения в той же мышцы в течение долгого времени, исчисляемым. В естественных условиях флуоресцентного метод визуализации была использована в основном для отслеживания роста опухолеиндуцирующего клетки, наше исследование показывает, что это мощный инструмент, который позволяет нам отслеживать судьбу трансплантированных стволовых клеток.
Protocol
Сотовые подготовки
- Спутниковое изолятор
- Под наркозом, конечности мышцы GFP трансгенных мышей (C57BL / Ка-βactin-EGFP) удаляются. После разрезания на мелкие кусочки, спутниковые клетки ферментативно диссоциированных путем инкубации измельченной ткани с 2% раствором коллагеназы dispase в течение 1 часа при температуре 37 ° C.
- Нейтрализовать ферментативного расщепления с ростом сред, содержащих Хэма F-10 и 20% ЭТС, диссоциирует мышц повторными растирания с пипетки Пастера. Клетки фильтруется через ячейки сетчатого фильтра (ø70-100 мкм), а затем высевают на без покрытия блюдо в течение 1 часа при температуре 37 ° C.
- Аккуратно удалите супернатант и пластины их на коллаген покрытием блюдо. Повторите этот шаг через 1 час, чтобы очистить миобластов. (До пластины)
- Изменение средств массовой информации и пластины клетки во времени. Окончательный очищенной миобластов культивируются в среде, содержащей Хэма F-10, 20% ЭТС, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина (ростовой среды) при 37 ° C с 5% CO2, 95% воздуха.
- Культура и расширение первичного миобластов в ростовой среде с добавлением основных FGF 10 нг / мл.
- Для всех экспериментов в естественных условиях, мы вводим 5х10 5 клеток в мышцах ТП.
- При заготовке миобластов, отсоединяем клетки с помощью 0,25% трипсин / ЭДТА и мыть их с PBS в два раза. Числа клеток считаются с гемоцитометра и клетки ресуспендировали в HBSS в концентрации 5х10 4 клеток / мкл. Сосредоточены клеток в HBSS размещены на льду и вводят в течение 1 часа после сбора.
В Vivo изображений
- Мужской мышей MDX в возрасте 4-6 недель, закупаются у Джексона лаборатории и поддерживается на объекте содержания животных.
- Примерно через неделю проживания с окружающей средой, мышей готовы быть имплантированы культуре клеток.
- До трансплантации клеток, мышь под наркозом путем внутрибрюшинного (ф) инъекция смеси кетамина (100 мг / кг) и Ксилазин (10 мг / кг). Затем волосы вокруг области мышц Т. А. удаляется путем применения Наир в ногу и ждет 30 секунд, чтобы протереть чистой дистиллированной водой.
- В то время как мыши все еще под наркозом, 5х10 5 клеток в 10 мкл HBSS медленно вводят в каждую мышцу Т.А. на 3 точки с помощью иглы 30 калибра.
- После шага 4, мышь может быть регулярно изображено в естественных условиях флуоресценции. Флуоресценции станции NightOwl LB981 (Berthold Technologies, Inc), оснащенная высокочувствительной ПЗС камеры, используется для получения изображений с задних лап мышей.
- В день в естественных изображений, мы сначала проверяем рост волос на мышцы ТП. При необходимости мы повторно применить Наир, чтобы удалить волосы, как описано выше, после обезболивающих мышь со смесью кетамин и Ксилазин.
- В то время как мыши под анестезией, мы размещаем мыши в положении лежа на кусок черного не-флюоресцентная бумага (черная бумага Artagain из Стратмор). Для полного доступа ТА мышцы для улучшения изображения, мы ленты задних лап на бумагу.
- Мы размещаем мыши в камеру изображения и положение задней ноги, чтобы быть отображены в центре поля зрения камеры. Сначала переключить выбросов фильтр принимать традиционные серого фотографические картины ногу с временем экспозиции 5 секунд. Отрегулируйте положение мыши и фокус камеры, если необходимо. Визуализации параметров, включая время воздействия (1250 мс), высота образца (0,9 см) и т.д. остаются постоянными в процессе экспериментальной.
- Мы затем переключиться в соответствующий фильтр выбросов для зеленого флуоресцентного белка длиной волны. Мы принимаем флуоресценции изображение с временем экспозиции 1250 мс и биннинга номер 1. После обработки изображений, мыши удаляется из изображения камеры в клетку ждать восстановления.
- Для анализа мы обращаем области интереса (ROI) по флуоресцентные сигналы, чтобы измерить их интенсивность в терминах фотонов в секунду. Мы также измерить размер возврата инвестиций с точки зрения количества пикселей в качестве еще одного количественного значения. Визуализации эксперименты можно повторять раз в неделю или чаще, в течение нескольких месяцев, в случае необходимости, приобретать продольных данных.
В конце экспериментов, мыши эвтаназии и мышцы Т. собирают для анализа гистологии.
Discussion
Мы создали надежную и стабильную платформу визуализации для отслеживания флуоресценции меченых трансплантированных клеток в принимающих скелетных мышц в этом исследовании. GFP-меченых миобластов из GFP трансгенные мыши обозначает тип стволовых клеток, которые будут кандидатами в клеточной терапии в будущем. Постоянной манипуляции, включая сотовые номера, инъекции клеток, ясный фон, изображение положение и машина параметр имеет важное значение для получения высокого качества изображения и, особенно, для количественного анализа.
Флуоресценции имеет множество применений в области биомедицинских исследований, как это неинвазивный, простой в использовании и имеет высокую пропускную способность. Кроме того флуоресценции может обеспечить количественное измерение основано на фотоотсчетов, хотя из-за рассеяния, ослабления и поглощения, свет не может проникнуть на большое расстояние в ткани, что является недостатком метода. Усилия продолжаются уже использовать красный или ближней инфракрасной репортер увеличить глубину проникновения света.
Еще одно преимущество флуоресценции является то, что переводимые в клиники, если конкретные флуоресцентные репортер, предназначен для использования человеком. По сравнению с МРТ, КТ и ПЭТ, флуоресценции обладает высокой гибкостью, поскольку она не требует дорогостоящего оборудования и визуализации агентов. Одним из примеров является флуоресценция основе эндоскопа и микро-эндоскоп, которые были использованы в клинике. Объединив флуоресценции с другими методами, мы ожидаем достичь возможности получения как анатомические и функциональные информацию о лежащей в основе биологических процессов.
Acknowledgments
Работа Z и Y Ян Ван стало возможным благодаря гранту от K02 AR051181 NIAMS / NIH, гранты от мышечной дистрофии ассоциации и Гарвардского института стволовых клеток для Y Ван. Работа Q Цзэн и X Сюй поддерживает программу грантов присуждено Оптический Лаборатории изображений из Brigham и женской больницы. Авторы хотели бы поблагодарить Вэнь Лю из Департамента анестезии, BWH, за техническую помощь в ячейке работы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NightOwl LB981 | Berthold Technologies |
References
- Ballou, B., Ernst, L. A., Waggoner, A. S. Fluorescence imaging of tumors in vivo. Curr Med Chem. 12, 795-805 (2005).
- Green, fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Godavarty, A., Sevick-Muraca, E. M., Eppstein, M. J. Three-dimensional fluorescence lifetime tomography. Med Phys. 32, 992-1000 (2005).
- Graves, E. E., Weissleder, R., Ntziachristos, V. Fluorescence molecular imaging of small animal tumor models. Curr Mol Med. 4, 419-430 (2004).
- Graves, E. E., Yessayan, D., Turner, G., Weissleder, R., Ntziachristos, V. Validation of in vivo fluorochrome concentrations measured using fluorescence molecular tomography. J Biomed Opt. 10, 44019-44 (2005).
- Gurfinkel, M., Ke, S., Wen, X., Li, C., Sevick-Muraca, E. M. Near-infrared fluorescence optical imaging and tomography. Dis Markers. , 107-121 Forthcoming.
- Lee, J., Sevick-Muraca, E. M. Three-dimensional fluorescence enhanced optical tomography using referenced frequency-domain photon migration measurements at emission and excitation wavelengths. J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis. 19, 759-771 (2002).
- In vivo fluorescence imaging of muscle regeneration by transplanted eGFP-labeled myoblasts. Xu, X., Yang, Z., Liu, Q., Wang, Y. Annual Meeting of American Society of Gene Therapy, 2008 May 28-June 1, Boston, Ma, , American Society of Gene & Cell Therapy. Milwaukee, WI. (1985).
- Hoffman, R. M. In vivo cell biology of cancer cells visualized with fluorescent proteins. Curr Top Dev Biol. 70, 121-144 (2005).
- Coulton, G. R., Morgan, J. E., Partridge, T. A., Sloper, J. C. The mdx mouse skeletal muscle myopathy: I. A histological, morphometric and biochemical investigation. Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 53-70 (1988).
- Morgan, J. E., Partridge, T. A. Muscle satellite cells. Int J Biochem Cell Biol. 35, 1151-116 (2003).
- Mendell, J. R., Kissel, J. T., Amato, A. A., King, W., Signore, L., Prior, T. W., Sahenk, Z., Benson, S., McAndrew, P. E., Rice, R. Myoblast transfer in the treatment of Duchenne's muscular dystrophy. N Engl J Med. 333, 832-838 (1995).
- Bogdanovich, S., Perkins, K. J., Krag, T. O., Khurana, T. S. Therapeutics for Duchenne muscular dystrophy: current approaches and future directions. J Mol Med. 82, 102-115 (2004).
- Morgan, J. E., Coulton, G. R., Partridge, T. A. Mdx muscle grafts retain the mdx phenotype in normal hosts. Muscle Nerve. 12, 401-409 (1989).
- Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L., Wagers, A. J. Determinants of skeletal muscle contributions from circulating cells, bone marrow cells, and hematopoietic stem cells. Stem Cells. 22, 1292-1304 (2004).
- Cerletti, M., Jurga, S., Witczak, C. A., Hirshman, M. F., Shadrach, J. L., Goodyear, L. J., Wagers, A. J. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134, 37-47 (2008).
