Summary
이것은 zebrafish에 대한 높은 처리량 정자 cryopreservation 프로토콜입니다. 정자는이 프로토콜을 사용하면 이후의 체외 수정에 25 % 다산의 평균을 가지고 있으며, 수년 동안 안정 cryopreserved.
Abstract
이것은 하비 방법 (하비 외., 1982)의 적응이다 zebrafish의 정자 cryopreservation위한 방법입니다. 우리는 모두 절차를 간소화하고 향상 샘플 균일성 원래 프로토콜 두 가지 변경 사항을 도입했습니다. 첫째, 우리는 cryoprotectant를 포함하지 않는 동결 미디어를 사용하는 모든 정자 볼륨을 정상화. 둘째, cryopreserved 정자 대신 모세관 튜브의 cryovials에 저장됩니다. (δ ° C / 시간)를 동결 융해 정자의 가격은 아마도이 프로 시저에서 제어하는 두 가지 가장 중요한 변수이다. 이러한 이유로, 지정된들을 위해 다른 튜브를 대체하지 않습니다. 그것이 팀 작업하면 ~ 2 시간에 팀 당 100 남성의 정자를 동결 수 있습니다. 정자는이 프로토콜을 사용하면 25 % 다산의 평균을 가지고 (수정된 달걀의 총 수로 나눈 체외의 수정에에서 발생 가능한 배아의 숫자로 측정)이 %로 다산은 많은 년간 안정 cryopreserved.
Protocol
부품 A : 정자의 냉동 솔루션
1. 진스 버그 생선 링거스 (매 3 일마다 새로 만들어, 긴스버그, 1963)
참고 : 추가할 주문 석출을 방지하는 것이 중요합니다
450 년 ML 살균 ddH2O는 디졸브 :
- NaCl 3.25 g
- KCl 0.125 g
- CaCl2 • 2 H2O 0.175 g
다음 추가 : - NaHCO3 0.10 g
4 무균 ddH2O하고 저장 ° C. 500 ML에 마지막으로 볼륨을 가지고
2. 냉동 매체 (신선한 매일 확인)
- 메탄올없이
- 긴스버그 피시는 10 ML 링거스 (온도는 실온).
- 가루 우유 밀크 1.5 GM
- 메탄올과 함께
참고 : 추가할 주문 석출을 방지하는 것이 중요합니다- 긴스버그 피시 9 ML (온도는 실온). 링거스
- 메탄올 1 ML
- 가루 우유 밀크 1.5 g
동결 미디어를 조립 후, 20 분 잘 섞는다. 궤도 흔드는 또는 로커에서. 사용하기 전에, 1 ML eppendorf 튜브로 나누어지는, 표면 거품을 피하고.
파트 B : 정자 동결에 필요한 자료
정자 동결에 필요한 자료
- 10 μl 일회용 pipettes (Fisherbrand 고양이 # 22-358697)
- MESAB / Tricaine를 포함하는 물고기 물 250ml 비커
- 시계 안경 (Pyrex 고양이 # 9985-75)
- P20 pipetman (또는 이에 상응하는 금액) 및 팁
- 스폰지 물고기 홀더 (압박하면서 남성을 개최)
- 위의 무대 조명과 현미경을 해부
- 플랫 포셉 (예 : Millipore 타입)
- 2.0ml 극저온 튜브 (코닝 고양이 # 430488)
- 10X10 cryoboxes (Nalgene 고양이 # 03-337 - 7AA)
- 스티로폼 용기는 잘게 조각 건조 ice1의 ~ 15cm로 가득
- 15 ML 원뿔 튜브 (팔콘 # 352099)
- 액체 질소를 포함하는 듀어 플라스크
- 긴 집게 (예 : CMS 피셔 의료 고양이 # 10 - 316B)
- Cryogloves
- 남성에 대한 복구 탱크
- 한 eppendorf 튜브은 메탄올없이 냉동 미디어로 가득
- 한 eppendorf 튜브는 메탄올과 함께 냉동 미디어로 가득
- Cryofreezer (예 : 테일러 - 워튼 K - 시리즈)
한 잘게 조각 드라이 아이스를 만들기위한 간단한 방법은 수건에 싸서 망치로 그것을 격파하는 것입니다. 보다 효율적인 방법은 드라이 아이스 연삭기, 예를 들어 클로슨 모델 RE - 2를 사용하는 것입니다.
파트 C : 정자의 동결 방법
- 모세관 튜브를 표시 : 전에 처음으로 (바닥에서 즉, 16.7 mm를, 그림 1.1을 참조하십시오.) 3.33 μl 수준의 연구소 펜으로 10μl 모세관 튜브를 표시합니다.
- MESAB / tricaine은 ( "Zebrafish 도서"에 요리법) 생선 물에 희석 포함하는 비커에 플레이스 남성 (S) : 남자를 마취
- DRY 물고기 : 일단 anesthetized는 플라스틱 숟가락을 사용하여 마취의 물고기가 밖으로 들고 부드럽게 복부 측면을 건조하기 위해 특별한주의를 기울이고, 종이 타월에 마른 생선을 얼룩. 그것이 철저하게 배설강 주위에 건조하는 것이 중요하므로 물이 정자를 활성화합니다. 스펀지 홀더에 위치 물고기, 복부 측면 접속 (그림 1.2). 항문 지느러미 주변 지역은 여전히 kimwipe로 부드럽게 건조하고 습한 경우. 정자를 조기 천천히하는데주의를 기울여야!
- 이곳은 모세 튜브와 함께 제공되는 고무 마우스 피펫 어댑터에 모세관을 표시했습니다. 어댑터 한 끝에 마우스 피스와, 다른 한편으로는 모세관 홀더를 가진 고무 호스입니다. 또는 모세관은 적절한 직경의 tygon 관의 짧은 조각을 통해 50μl 해밀턴 주사기에 연결될 수 있습니다.
- 플레이스의 범위에 따라 남성과 조심스럽게 모세관 튜브의 끝 부분을 사용하여 분리 골반 지느러미를 확산하여 urogenital 개방을 폭로.
- 정자를 수집합니다 부드럽게 부드러운 포셉 (예 : Millipore)와 물고기의 측면을 쓰다듬어하여 정자를 추방하거나 부드럽게 당신의 검지 손가락과 엄지손가락 사이의 물고기의 양면을 쥐어하여. 그것이 부드러운 흡입 (그림 1.2)를 사용하여 퇴학와 같이 모세관에 정자를 수집합니다. 정자와 함께 퇴학 수 있습니다 대변하지 마십시오.
- μl 3.3에 정자 볼륨을 정상화 : 정자 도달의 볼륨 또는이 모세관 (예 : 16.7 mm 이상)에 펜으로 표시를 초과하는 경우 8 단계로 진행합니다. 정자 볼륨 대상 볼륨에 도달하지 않는 경우, 메탄올 (그림 1.3)없이 고정 매체를 사용하여 펜 표시 볼륨을 정상화. 허용됩니다 정자의 최소 금액은 정자의 품질에 따라 다릅니다. 좋은 정자 흰색 불투명합니다. 불쌍한 정자는 물 보입니다. 1 μl 좋은 정자 (또는 3분의 1 대상) 2 μl 가난한 정자 (또는 3분의 2 대상) : 일반적으로, 우리는 최소로 받아들입니다. 볼륨은 지금 3.3 μl로 정상화됩니다.
- 정자에 CRYOPROTECTANT ADD : M과 함께 냉동 매체를 빨아오렌지 마르크 (.; 그림 1.4 약 총 볼륨이 현재 20 μl)로 에탄올. 거품을 소개하지 않도록 특별한주의를 기울이고, 시계 유리 청소 영역에 정자와 cryoprotectant 혼합물을 추방. 부드럽게 그리고 아래로 pipetting ~ 4 번 (거품을 도입하지 않도록)로 섞는다.
- 이 CRYOVIALS의 각 INTO 10μl 정자 장소 : 정자의 피펫 10 μl : 관련 정보 (그림 1.5)으로 표시되었습니다 두개의 cryovials 하단에 cryoprotectant 솔루션입니다. 신속하게 캡 튜브를 이동하고 실내 온도 15 ML 팔콘 튜브 - 원 cryovial / 튜브 하단에 그들을 놓으십시오. 캡 팰컨 관과 조각 드라이 아이스로 cryovial 함유 팰컨 튜브의 쌍을 삽입합니다.
- 20 분 정자 꼼짝마. DRY ICE ON : 드라이 아이스 괜찮 분말 형태가 아닌 알약에 있어야합니다. 튜브는 깊은 정도만이 자신의 모자가 (그림 1.6) 표시되는 드라이 아이스에 삽입해야합니다. 드라이 아이스에 튜브를 추적하기 위하여, 팰컨 튜브의 각 쌍의에게 1-20 사이의 숫자를 (뚜껑에 작성)을주고 그들이 드라이 아이스에 들어가 시간을 기록합니다.
- 액체 질소 INTO 플레이스 CRYOVIALS이 :. 정자 20 분 드라이 아이스에 동결되고 나면, 액체 질소 함유 듀어 플라스크를 그들을 전송할 수 있습니다. 정자는 액체 질소 냉동고에 장소 시간까지 여기에 저장됩니다. 샘플가 가열되지 않도록 액체 질소의 목욕에있는 냉장고 상자에 배치, 장소 냉장고 상자. 듀어 플라스크에서 튜브를 복구하고 cryogloves로 처리하는 긴 금속 집게를 사용하십시오. 냉동고 박스 스티로폼 용기에 액체 질소에 보관 포장되어있는 경우 또는 cryovials는 냉동실 상자에 드라이 아이스에서 직접 전송하실 수 있습니다.
- 극저온 액체 질소 냉동고에 저장 cryovials이 장기. 정자의 생존을 유지하기 위해서는 튜브는 액화 질소에 포장되어 저장하는 것이 중요합니다. 우리의 경험에서, 기상 위상에 저장된 튜브는 시간이 지남에 따라 경쟁력을 잃게됩니다.
속도는 중요하다! cryoprotectant를 추가하고 (즉, 단계 6-10) 드라이 아이스에서 정자 튜브를 삽입 사이의 시간이 더 이상 30 초되어야합니다.
파트 D : Cryopreserved 정자를 사용하여 체외 수정의 방법
우리는이 두 사람과 가장 잘 작동 것을 발견했습니다. 다른 사람이 정자는 녹아서 동안 한 사람이 여성에서 달걀을 했군.
- 33 ° C.에 물 목욕을 설정
- 액체 질소 함유 해동 준비까지 듀어 플라스크를 액체 질소 냉동고 및 전송에서 cryovial 제거합니다.
- 35mm 플라스틱 페트리 접시로 여성의 난자를 짜내. 가능하면, 계란 3 클러치를 얻는 하나의 그릇에 결합하려고합니다. 당신이 첫 번째 클러치 1 분 안에 3 좋은 클러치를 얻을 수 없다면 (한 좋은 클러치가 충분합니다) 4 단계로 진행합니다. 좋은 클러치의 정의 :> 150 균일하게 잘보고 달걀 (예 : 노란, 열화 지표없이 하얀 잔해와 함께). 정자가 해동되는 동안 대상 음식 보관하십시오.
- 액체 질소의 병을 제거하고 뚜껑을 제거합니다. 33 80-10 초에 대한 ° C 물 목욕으로 신속하게 담가 병에 ~ 1 / 2 방법입니다.
- 신속하고 위아래로 pipetting하여 유리병과 혼합 70 μl 방 온도 행크스를 추가합니다. 즉시 계란에 추가하고 피펫 팁과 함께 부드럽게 섞는다.
- 지체없이, 750 μl 물고기 물을 추가하여 정자와 난자를 활성화해야합니다. 섞어 소용돌이. 실온에서 5 분 알을 품다.
- 5 분 후, 28에서 생선 물 품어 요리와 요리를 기입 ° C. 2-3 시간 후, 개수 및 100mm 요리 (50/dish)에 비옥한 배아를 전송합니다. 수정 주파수가 결정 수 있도록 불임 계란을 계산합니다.
- 애벌레 잘 부탁해! 처음 5 일 동안 매일 물을 변화와 죽은 태아를 제거합니다. 일 5 보육에 수영 bladders가있는 애벌레를 넣어.
부품 E : 대표 결과
우리는 년 2001 년에서 2003 년 사이 틸링에 대한 8600 냉동 정자 샘플 라이브러리를 만들기 위해이 crypreservation 방법론을 사용. 우리는이 샘플 106를 해동하고 불임을 결정했습니다. 다산은 냉동 정자와 함께 수정된되었습니다 계란의 총 수로 나눈에서 체외의 수정에서 생산 가능한 배아의 비율입니다. 신선한 (cryporeserved 비) 정자 일반적으로> 95 %의 불임있다; cryopreserved 정자가 훨씬 낮은 불임을 가지고 : 29 % (N = 106 병)의 평균. 다산의 유리병 - 투 - 유리 변화는 1 % 미만 62 %로 높이에 이르는 대형이다. 이 변화는 그림에서 표준 편차를 나타내는 큰 오차 막대로 표시됩니다. 2. 그러나 우리가 한 번만 정자 샘플을 모두 0 % 불임을 경험하고 해당 틸링 변이를 복구하는 실패 날짜 해동 106 정자 샘플 인치
몇 년간의 과정을 통해 우리 도서관에서 정자 튜브를 해동하여 (2001년에서 2008년까지) 우리는이 방법으로 냉동 정자 샘플의 평균 불임 남아 것으로 나타났습니다안정 시간이 지남에 (그림 2). 2001 년 해동 냉동 정자 샘플의 평균 다산은 23.5 % (11 정자 샘플에 따라 이전) 2008 25 % (21 정자 샘플을 기반으로)되었습니다.
다른 조사의 숫자는 이제 실험실에서 정자 동결 프로토콜을 사용하고 있습니다. 일부는 우리가 관찰한 것을과 비슷한 불임 속도와 샘플 - 투 - 샘플 변화와 좋은 성공을보고있다. 기타 보도에 따르면이 프로토콜들은 손에 작동하도록하는 데 실패했습니다. 우리는 문제의 가능성이 소스가 생각 :
- ; 때 드라이 아이스로 냉각의 다른 속도로 이어지는, 우리가 프로토콜의 제안이 정확한 cryovials 또는 원뿔 튜브를 사용하지 않으면
- , 하위 최적의 냉각 속도로 이어지는, 분말 드라이 아이스를 사용하지 않으면
- 가난한 다산과 남성의 물고기를 사용 : 당신은 한 남성으로부터 정자 최소한 1 μl를해야합니다. 그것이 100 % 다산 접근하는 것은 매우 신선한 정자를 필요하기 때문에 당신은 또한 신선한 정자와 체외의 수정에를 수행하여 남성 불임을 테스트할 수 있지만이 오해하실 수 있습니다.
- 에서 체외의 수정에 하위 표준 품질 계란을 사용합니다. 아무것도하지만 완벽한 클러치를 사용하면 항상 0 % 다산 가까운, 심지어 실제로 좋은 다산 (중복 유리병의 불임에 따라)가 정자 샘플에서 발생합니다.
그림 1. 정자 동결 방법론의 도식.
그림 2. Cryopreserved 정자 불임 시간이지나면서 안정 남아있다. 비율 다산의 냉동 정자와 함께 수정된되었습니다 계란의 총 수로 나눈에서 체외의 수정에서 생산 가능한 배아의 번호입니다. "N"은 다산 해당 연도에 테스트되었습니다 cryopreserved 정자 튜브의 개수를 나타냅니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 각 정자 약병은 다른 남자의 것이므로, 병에 - 투 - 유리 변화가 관찰됩니다.
Discussion
다른 조사의 숫자는 이제 실험실에서 정자 동결 프로토콜을 사용하고 있습니다. 일부 유사한 불임 우리가 관찰이 동일한 샘플 - 투 - 샘플 변화를보고있다. 기타 보도에 따르면이 프로토콜들은 손에 작동하도록하는 데 실패했습니다. 우리는 문제의 가능성이 소스가 생각 :
- ; 때 드라이 아이스로 냉각의 다른 속도로 이어지는, 우리가 프로토콜의 제안이 정확한 cryovials 또는 원뿔 튜브를 사용하지 않으면
- , 하위 최적의 냉각 속도로 이어지는, 분말 드라이 아이스를 사용하지 않으면
- 가난한 다산과 남성의 물고기를 사용 : 당신은 한 남성으로부터 정자 최소한 1 μl를해야합니다. 그것이 100 % 다산 접근하는 것은 매우 신선한 정자를 필요하기 때문에 당신은 또한 신선한 정자와 체외의 수정에를 수행하여 남성 불임을 테스트할 수 있지만이 오해하실 수 있습니다. 더 크고 견고하게 색깔 남성은 일반적으로 더 높은 품질의 정자를 제공합니다.
- 에서 체외의 수정에 하위 표준 품질 계란을 사용합니다. 아무것도하지만 완벽한 클러치를 사용하면 항상 0 % 다산 가까운, 심지어 실제로 좋은 다산 (중복 유리병의 불임에 따라)가 정자 샘플에서 발생합니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH R01 HG002995 지원했다 "Zebrafish 게놈 틸링 : 역방향 유전학 어프로치"CBM으로합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μl disposable pipettes | Fisher Scientific | 22-358697 | |
| Watch glasses | Pyrex | 9985-75 | |
| 2 ml cryogenic vials | Corning | 430488 | |
| 10 x 10 cryoboxes | Nalge Nunc international | 03-337-7AA | |
| 15 ml conical tubes | Falcon BD | 352099 | |
| Tongs | Fisher Scientific | 10-316B | |
| Cryofreezer | Taylor-Wharton | K-series | For example |
References
- Ginsburg, A. S. Sperm-egg association and its relationship to activation of the egg in salmonid fishes. J. Embryol. Exp. Morphol. 11, 13-33 (1963).
- Harvey, B., Kelley, R. N., Ashwood-Smith, M. J. Cryopreservation of zebra fish spermatozoa using methanol. Can. J. Zoology. 60, 1867-1870 (1982).
