Summary
Questo è un metodo per la generazione di embrioni di zebrafish gynogenetic diploide (embrioni il cui unico contributo genetico proviene dalla madre), bloccando la seconda divisione meiotica subito dopo la fecondazione con luce ultravioletta-inattivato sperma. Embrioni EP non sono completamente omozigoti per ricombinazione durante la prima divisione meiotica, tuttavia sono omozigoti a tutti i loci che non sono stati separati dalle loro centromero dalla ricombinazione.
Abstract
Eterozigosi negli eucarioti diploidi spesso rende studi genetici ingombrante. I metodi che producono prole vitale diploide omozigote direttamente dalle femmine eterozigoti permettono F1 femmine mutagenizzate di essere proiettati direttamente per le mutazioni deleterie in uno schermo accelerato in avanti genetica. Streisinger et al.
Protocol
Panoramica di pressione all'inizio
Nota: le ricette per molti dei reagenti utilizzati in questo protocollo come tricaine, pesci d'acqua salina e Hanks sono disponibili online nel capitolo 10 del Libro Zebrafish 3 ( http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html )
- Produrre embrioni da fecondazione in vitro con lo sperma UV inattivato.
- Trasferire immediatamente le uova fecondate in un flacone di vetro (con tappo a scatto di plastica) riempiti fino all'orlo di acqua uovo. Coprire l'estremità aperta del flaconcino con un sottile foglio di lattice di gomma e far scattare la parte superiore (in cui un foro è stato tagliato) sulla fiala sopra la gomma.
- Porre la fiala in una pressa idraulica e 1,4 minuti dopo la fecondazione aumentare la pressione a 8000 psi (Si noti che molte macchine sono tarati per leggere la pressione esercitata su un pistone da 2 pollici di diametro, e le letture devono essere convertiti in psi)
- Con inizio alle 6 minuti dopo la fecondazione, rilasciare la pressione gradualmente in un periodo di 1 min.
Dettagliata procedura di pressione all'inizio
- Giorno precedente esperimento
- Nel tardo pomeriggio, separati maschi e femmine per essere spremuto. Qualsiasi maschio può essere utilizzato dal momento che non sarà contribuendo materiale genetico. Femmine dovrebbe apparire grandi e grassi nel ventre. I maschi dovrebbe apparire giallo e spry.
- Tenere femmine e maschi separatamente durante la notte in serbatoi dove possono essere facilmente accessibili al mattino.
- Mattina di esperimento
- Preparare la soluzione Hanks, aggiungere bicarbonato di sodio.
- Portare a struttura pesce: secchiello del ghiaccio, Hanks, Tricaine, timer, tubi per la raccolta di sperma.
- Diluire Tricaine in acqua i pesci
- Raccogliere lo sperma
- Preparare una fiala di soluzione chiara Hanks sul ghiaccio. Misura circa 50 microlitri per ogni maschio a essere spremuto.
- Anestetizzare 3 o 4 maschi in un momento di immersione in tricaine. Possono essere tirato fuori l'anestetico con un cucchiaio di plastica.
- Risciacquare con acqua e asciugare i pesci "umido-secco" su un tovagliolo di carta (molto importante: l'acqua sperma attiva).
- Monte di pesce in un supporto di schiuma sotto uno stereomicroscopio a basso ingrandimento con epi-illuminazione. Separare le pinne pelviche con una pinza e posizionare un microcapillare in apertura della cloaca.
- Corsa ai lati del pesce delicatamente ma con fermezza, con liscio (Millipore) pinze.
- Come lo sperma lattiginoso uscire dal poro genitale, si raccolgono nei microcapillare con aspirazione delicata.
- Piscina allo sperma di maschi diversi in soluzione salina ghiacciata di Hank. Spermatozoi dei maschi 50-10 è adeguato per la fecondazione di diverse centinaia di uova. Spermatozoi nel freddo Hanks continuerà a fecondare le uova in modo efficiente per diverse ore o anche giorni. "Eyeball" la concentrazione di spermatozoi, raccogliendo abbastanza per fare una sospensione torbida.
- UV inattivare gli spermatozoi
- Riempire il fondo di un piatto di vetro Petri con ghiaccio.
- Mettere un vetro d'orologio in cima al ghiaccio nel piatto.
- Utilizzando una pipetta Pasteur, trasferire lo sperma dalla provetta sul vetro d'orologio. Essere sicuri di ottenere il maggior numero di spermatozoi nella pipetta possibile senza occupare eventuali bolle d'aria con essa. Inoltre, non bolla il seme nel vetro d'orologio, come li state espellendo dalla pipetta. Espellere lo sperma in un sottile e uniforme strato di vetro da orologio. Scarta questa pipetta.
- Porre la capsula di Petri in un UV cross-linker
- Accendere reticolante per 2 minuti
- Utilizzando una pipetta pulita, togliere lo sperma dal vetro d'orologio e trasferirlo ad una provetta Eppendorf segnato sperma UV e posto sul ghiaccio.
- Raccolta degli ovuli e la fecondazione in vitro
- Anestetizzare tre o quattro donne in un momento in tricaine.
- Risciacquare con acqua e asciugare i pesci "umido-secco" su un tovagliolo di carta. L'acqua in eccesso si gonfiano le uova e impedire la fecondazione.
- Posizionare la femmina in un piatto di plastica 35 millimetri di Petri e umido (non bagnato) barrette, premere delicatamente ma con fermezza sul ventre. Se lei è pronto a deporre le uova, che verrà fuori abbastanza facilmente.
- Raccogliere le uova con una spatola e tornare la donna in acqua. Le uova sono un buon giallo, colore traslucido, che le uova che sono rimasti nella femmina troppo a lungo sono di colore bianco e acquoso (vedi sotto). Per assicurarsi di andare uova buone, li raccolgono durante le prime 2 ore dopo che le luci si accendono nella struttura di pesce. Tenere le uova al coperto per evitare l'essiccazione-out.
- Aggiungere 30-50 ml di sospensione sperma UV per le uova, mescolate delicatamente con la punta della pipetta.
- ImmediatoLy aggiungere circa 1 ml di acqua pesce e avviare il timer. Uova rimaste per lo sviluppo, a questo punto sarà haploids.
- . Pressione primi Nota: la procedura ag deve essere eseguita entro 90 secondi di fecondazione!
- Avvia timer momento che le uova vengono attivate con l'aggiunta di acqua
- Attendere qualche minuto e aggiungere altra acqua, agitare le uova al centro del piatto.
- Usando un cut-off e lucidato pipetta Pasteur, trasferire le uova fecondate al fiale di pressione.
- Se necessario, aggiungere acqua uovo di più per le fiale in modo che siano quasi straripante, lasciando una goccia d'acqua a bordo della fiale.
- Posizionare un tappo in gomma sulla goccia di acqua e fissare il coperchio di plastica sopra la gomma.
- Posizionare il flaconcino (s) a testa in giù nel cilindro a pressione, aggiungendo acqua uovo di più per riempire il cilindro. Mettere la parte superiore del cilindro in modo sicuro.
- Posizionare il cilindro nella stampa con lo stantuffo e applicare 8.000 £ / mq. in
- Lasciare il cilindro nella stampa fino a 6 minuti dopo il tempo di attivazione (per un tempo totale di 4,5 min di pressione).
- A 6 minuti dopo l'attivazione, rimuovere il cilindro dalla stampa, e togliere i flaconcini dal cilindro. Asciugare con cura le fiale per evitare un raffreddamento degli embrioni.
- Resettare il cilindro e riempirlo con l'acqua uovo.
- Preparare i flaconi parzialmente loro successivo riempimento con acqua uovo, se necessario.
- Ripetere l'operazione per tutte le partite di uova.
NOTA: Il cilindro può contenere fino a 3 flaconcini alla volta, quindi si consiglia di ritardare la fecondazione di uova qualche minuto per vedere se altre femmine già nel tricaine dare uova. Ciò contribuirà ad accelerare trattando più lotti allo stesso tempo. Inoltre, ricorda una volta che la stampa è in uso non inserire tutti i pesci più nel tricaine fino a quando il trattamento è stato completato. Permettendo di pesce di rimanere in anestesia troppo lungo può ucciderli. In secondo luogo, se si spremere i pesci, mentre la stampa è in uso, e ottenere le uova, possono essere troppo secca per essere valida al momento della stampa può essere riutilizzato.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
E 'importante assicurarsi che gli embrioni prodotti con questo metodo sono diploidi gynogenetic vero. Come controlli, generano una frizione delle uova diploidi normali (tenendo da parte alcune delle spermatozoi senza UV-inattivazione) e una serie di embrioni aploidi (tenendo da parte una frizione delle uova fecondate con gli spermatozoi UV senza passare per la procedura di PE). A 1 giorno dopo la fecondazione degli embrioni aploidi hanno un asse corto del corpo, il cervello e la morfologia irregolare somite. Haploids non sono vitali dopo 2-3 giorni. Diploidi PE dovrebbe assomigliare diploidi normali, anche se alcuni irregolari "mostri EP" può verificarsi. Grinfie di diploidi PE dovrebbe essere in gran parte (70-90%) praticabile. La presenza di haploids nella frizione diploide PE propone un fallimento nel processo di PE (per esempio, la stampa ha omesso di considerare la pressione). La presenza di diploidi nella frizione aploide suggerisce inattivazione incompleta sperma (per esempio un errore nel reticolante).
Diploidi EP sono stati utilizzati per determinare gene-centromero distanze da 1 a mutanti mappa identificati in avanti schermi genetica 4,6. Avanti schermi di embrioni diploidi EP sono un modo efficiente per identificare i geni coinvolti nei processi sia presto e poi di sviluppo e vengono utilizzati oggi 5,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Metodi per la fecondazione in vitro e diploidi gynogenetic sono stati sviluppati per zebrafish da Charline Walker nel laboratorio di Giorgio Streisinger presso l'Università dell'Oregon negli anni 1970 e 1980. Il metodo descritto qui è invariato rispetto a protocolli Charline, che sono disponibili per intero nel Libro Zebrafish 3.
Metodi per la fecondazione in vitro e diploidi gynogenetic sono stati sviluppati per zebrafish da Charline Walker nel laboratorio di Giorgio Streisinger presso l'Università dell'Oregon negli anni 1970 e 1980. Il metodo descritto qui è invariato rispetto a protocolli Charline, che sono disponibili per intero nel Libro Zebrafish 3.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | ||
| Watch glass | |||
| French Press | |||
| Pressure cylinder | |||
| Instant ocean | |||
| Pasteur pipettes | Cut off the narrow end, fire polish | ||
| UV cross-linker | |||
| microcapillaries |
References
- Streisinger, G. Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish. Genetics. 112 (2), 311-311 (1986).
- Streisinger, G. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-293 (1981).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).
- Johnson, S. L., Africa, D., Horne, S., Postlethwait, J. H. Half-tetrad analysis in zebrafish: mapping the ros mutation and the centromere of linkage group I. Genetics. 139 (4), 1727-1727 (1995).
- Beattie, C. E., Raible, D. W., Henion, P. D., Eisen, J. S. Early pressure screens. Methods Cell Biol. 237 (71), 2575-25 (1999).
- Johnson, S. L. Centromere-linkage analysis and consolidation of the zebrafish genetic map. Genetics. 142 (4), 1277-1277 (1996).
- Trede, N. S. Zebrafish mutants with disrupted early T-cell and thymus development identified in early pressure screen. Dev Dyn. 237 (9), 2575-2575 (1999).
