Summary
Una morte saggio basato su cellule di PTI in piante di Nicotiana benthamiana è descritto.
Abstract
Percepire potenziali patogeni nel loro ambiente, le piante usano recettori pattern recognition (PRR) presenti sulla loro membrana plasmatica. PRR riconoscere caratteristiche microbiche conservato chiamato pattern molecolare patogeni associati (PAMPs) e questo porta alla rilevazione PAMP-triggered immunità (PTI), che previene efficacemente la colonizzazione dei tessuti vegetali da parte di non-patogeni 1,2. Il sistema più ben studiata nel PTI è il FLS2-dipendente 3 percorso. FLS2 riconosce il flg22 PAMP che è un componente di flagellina batterica.
Agenti patogeni di successo possiedono fattori di virulenza o effettori che possono sopprimere PTI e permettere al patogeno di causare malattie 1. Alcune piante, a loro volta in possesso di geni di resistenza che rilevano effettori o la loro attività, che porta a effettrici-triggered immunità (ETI) 2.
Descriviamo una morte saggio basato su cellule di PTI modificato da Oh e Collmer 4. Il test è stato standardizzato in N. benthamiana, che viene utilizzato sempre più come sistema modello per lo studio delle interazioni pianta-patogeno 5. PTI è indotta da infiltrazione di un non-patogeno ceppo batterico in foglie. Sette ore dopo, un ceppo batterico che causa la malattia sia o che attiva ETI è infiltrato in una zona di sovrapposizione la zona di infiltrazione originale. PTI indotta dalla infiltrazione prima è in grado di ritardare o impedire la comparsa di morte cellulare a causa delle infiltrazioni seconda sfida. Al contrario, l'aspetto della morte cellulare nella zona di sovrapposizione di inoculazione indica la ripartizione dei PTI.
Quattro diverse combinazioni di induttori del PTI e vaccinazioni sfida sono stati standardizzati (Tabella 1). Il test è stato testato in materia di non tacere N. piante benthamiana che serviva come il controllo e le piante a tacere per FLS2 che sembravano destinate a essere compromessi nella loro capacità di sviluppare PTI.
Protocol
Parte 1: La crescita delle piante e la manutenzione
Nicotiana benthamiana impianti utilizzati nel test dovrebbe essere di circa 7 settimane di vita. Essi dovrebbero essere tagliati almeno 4-5 giorni prima del test di rimuovere tutti i rami ascellari e fiori. E 'una buona idea per rimuovere rami ascellari subito dopo emergono in modo da rendere le piante più gestibile.
Parte 2: coltura batterica
GIORNO 1:
- Piastre o culture per tutti i ceppi utilizzati nel test sono iniziati allo stesso tempo. Per la Pseudomonas spp. tra cui 2 induttori e 3 ceppi di sfida, i batteri striscia su piastre KBM contenenti antibiotici appropriati dalle scorte glicerolo congelati (tabella 2). Una piccola quantità di batteri dovrebbero essere diffuse al centro del piatto. Incubare la piastra a 30 ° C per circa 18-24 ore. Per Agrobacterium, avviare una coltura liquida in 2 ml di LB da un piatto fresco e crescere durante la notte a 250 rpm, 30 ° C.
2 ° GIORNO:
- Per Pseudomonas, aggiungere 150-200 ml di liquido KBM ai batteri e li stendevano sulla intera piastra utilizzando una spatola sterile di vetro. Mettere la piastra posteriore nell'incubatrice e lasciarlo crescere per un altro 20-24 ore. Ci dovrebbe essere un prato batterica sul piatto il giorno seguente, che indica una buona crescita. Per Agrobacterium, avviare una cultura secondaria LB in circa 5-10 ml con 20 acetosyringone mM e lasciarlo crescere durante la notte per 20 ore a 250 rpm, 30 ° C.
Parte 3: impianti di Preparazione per il test
2 ° GIORNO:
- Un giorno prima del test le piante dovrebbero essere spostati in una stanza a 22-24 ° C, ~ luce del 35-40% di umidità relativa e costante.
- Segna cerchi sulle foglie che sono almeno 1,5 cm di diametro con un pennarello nero spesso. Da due a quattro cerchi può essere contrassegnato per anta. I cerchi dovrebbero essere ben distanziati e preferibilmente non attraversare un grande vena. Scegli bene espanso foglie. Evitare di foglie più vecchie o foglie che sono difficili o spesso al tatto e di evitare la marcatura cerchi sulle parti inferiore della foglia.
Cerchi segnando un giorno prima l'esperimento non è essenziale per il protocollo. Tuttavia, fa risparmiare tempo se ci sono un gran numero di piante di essere analizzati, e rende più facile per raggiungere tempistica precisa tra l'induzione di PTI e vaccinazioni sfida.
Parte 4: Induzione di PTI
3 ° GIORNO:
- Raccolta le cellule dalla piastra in mM MgCl 10 2 per P. fluorescens e P. putida. Per Agrobacterium, centrifuga della cultura per raccogliere le cellule e risospendere in 10mM MgCl 2 + 10 mM MES pH 5,6. Ripetere la centrifugazione e risospendere in MgCl 2-MES soluzione. Misurare la densità ottica (DO) delle celle a 600 nm. Regolare l'OD per i valori finali richiesti come descritto nella tabella 2. Pseudomonas dovrebbe essere infine risospeso in 10 mM MgCl 2 e Agrobacterium nel MgCl 2-MES soluzione. Un volume totale di 25 ml è sufficiente per inoculare circa 40-50 punti.
- Infiltrarsi nel induttori PTI nel pre-segnato cerchi sulle foglie utilizzando una siringa da 1 ml senza ago. Scrivere l'ordine in cui sono stati infiltrati nelle piante e l'ora esatta in cui l'infiltrazione è stata iniziata.
Parte 5: inoculazione sfida
- Preparare P. syringae pv. pomodoro DC3000, DC3000 Δ hopQ1 Pst-1 e Ps pv. tabaci per la sfida, come descritto nella parte 4.1 e Tabella 2.
- Sette ore dopo l'infiltrazione induttore, eseguire l'infiltrazione sfida nello stesso ordine delle piante come l'induzione è stato fatto. In generale, un punto sulla periferia del cerchio prima inoculazione può essere utilizzato come il centro del cerchio seconda inoculazione. Se ci sono macchie più su una foglia quindi assicurarsi che le infiltrazioni non si sovrappongano.
- Diluizioni seriali di tutte le culture usato nel test su piastre KBM o LB contenente l'antibiotico appropriato per determinare il numero esatto CFU.
Parte 6: punteggio per la ripartizione dei PTI
Giorno 5:
- Cercare la comparsa di morte cellulare a causa di ETI nei luoghi che si sono sfidati con Pst DC3000. La morte cellulare dentro l'area di sovrapposizione di infiltrazione indica la ripartizione dei PTI e risposta deve essere un fenotipo positivo.
Giorno 7:
- Cercare la comparsa di morte cellulare a causa di malattia nei luoghi che si sono sfidati con Pst DC3000 Δ hopQ1-1 o Ps pv. Tabaci
Quando le piante di controllo (che non deve essere compromessa per PTI) iniziano a mostrare la morte cellulare nella zona di sovrapposizione di infiltrazione, smettere di fare ulteriori osservazioni.
Parte 7: I risultati rappresentativi
La figura 1 mostra il risultato di un test in cui P. fluorescens è stato utilizzato come induttore e DC3000 Pst come la sfida.
Figura 1. P. fluorescens era infiltrata sul N. benthamiana foglie (cerchio nero) per indurre PTI e 7 ore dopo, il luogo è stato contestato con Pst DC3000 (cerchio bianco). Impianti a tacere per FLS2 ha mostrato un crollo del PTI nella regione in cui P. fluorescens era infiltrata (A), come si vede dalla morte cellulare. Impianti di controllo che non sono stati ridotti al silenzio non ha mostrato la morte delle cellule nella zona di sovrapposizione a causa dell'induzione di PTI (B). Frecce rosse indicano la mancanza o la presenza di morte cellulare nella zona di sovrapposizione di infiltrazione. Fotografie sono state scattate 2 giorni dopo le infiltrazioni. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande della figura 1.
| PTI induttore | Cellule morte suscitando sfida | Natura della morte cellulare | Codice |
| Pseudomonas fluorescens 55 | Pseudomonas syringae pv pomodoro (Pst). DC3000 6 | ETI | Pf / DC |
| P. putida KT2440 | Pst DC3000 | ETI | Pp / DC |
| P. fluorescens 55 | Pst DC3000 Δ hopQ1-1 6 | Malattia | Pf/Q1-1 |
| Agrobacterium tumefaciens GV2260 | P. syringae pv. tabaci 11528R | Malattia | Agro / ptab |
Tabella 1: Combinazioni di indurre la morte delle cellule e PTI-suscitando microbi utilizzati nel test delle cellule morte per PTI.
| Ceppo batterico | Selezione di media | Finale OD utilizzati nell'esperimento | Corrispondenti CFU / ml |
| P. fluorescens 55 | KBM ampicillina (100 ug / ml) | 0,5 | 1 x 10 9 |
| P. putida KT2440 | KBM ampicillina (100 ug / ml) | 0,5 | 1 x 10 8 |
| A. tumefaciens GV2260 | LB Rifampicina (100 ug / ml) | 0,5 | 5 x 10 8 |
| Pst DC3000 | KBM Rifampicina (100 ug / ml) | 0,02 | 2 x 10 7 |
| Pst DC3000 Δ hopQ1-1 | KBM Rifampicina (100 ug / ml) | 100 volte diluizione di 0,1 | 1 x 10 6 |
| P. syringae pv. tabaci 11528R | KBM Rifampicina (100 ug / ml) | 100 volte diluizione di 0,1 | 1 x 10 6 |
Tabella 2: condizioni di coltura e livelli di inoculo utilizzato nel saggio. L'OD e corrispondenti livelli di CFU può variare tra di marca diversa spettrofotometri.
Discussion
Morte a base della cellula test può essere usato per determinare il coinvolgimento di un gene nel PTI. Per esempio, la perdita di funzione mutanti per un gene di interesse può essere provata da questo test. Dei 4 combinazioni di induttore e inoculazioni sfida riportati nella tabella 1, è possibile che una sola combinazione può causare un fenotipo in fondo dell'impianto. Abbiamo osservato che le piante a tacere per FLS2 mostrano una ripartizione del PTI nel Pf / DC e Pf/Q1-1 combinazioni di induttore e vaccinazioni sfida (tabella 1).
E 'essenziale che le condizioni ambientali per il saggio sono il più vicino possibile a quelli descritti nella Parte 3.1. Bassa umidità provoca la morte cellulare per procedere troppo velocemente, rendendo difficile il test di segnare. Se le condizioni descritte nel nostro protocollo non lavorano nel vostro laboratorio, poi provare a modificare il livello di induttore o inoculazione sfida. Un altro parametro che può essere modificato è il divario di tempo tra induzione e di sfida, anche se abbiamo trovato che le lacune più breve tempo ha causato il saggio di abbattere troppo in fretta negli impianti di controllo.
Si consiglia di almeno 4-5 impianti essere testato in un esperimento e un fenotipo positivo deve essere ripetuto in almeno 3-4 esperimenti indipendenti.
Acknowledgments
Ringraziamo Hye-Sook Oh, Joanne Morello e Alan Collmer, Dipartimento di Patologia Vegetale e Plant-Microbe Biologia, Cornell University, per le discussioni importanti. Ringraziamo Jesse Munkvold per commenti su questo articolo. Il finanziamento è stato fornito dal Programma Nazionale Genoma Plant Science Foundation, il numero di riconoscimento DBI-0605059 (GBM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES | Fisher Scientific | BP300-100 | Prepare as a1M stock, adjust pH and filter sterilize. Store at room temperature. |
| Life Science UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter Inc. | DU 730 |
References
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- Zipfel, C., Robatzek, S., Navarro, L. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Nature. 428 (6984), 764-764 (2004).
- Oh, H. S., Collmer, A. Basal resistance against bacteria in Nicotiana benthamiana leaves is accompanied by reduced vascular staining and suppressed by multiple Pseudomonas syringae type III secretion system effector proteins. Plant J. 44 (2), 348-348 (2005).
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