Summary
Karyotypering is een eenvoudige en nuttige techniek op grote schaal gebruikt voor het opsporen van genetische veranderingen. Hier beschrijven we een stap voor stap protocol voor het chromosoom verspreiden bereiding van menselijke embryonale stamcellen voor het toezicht op de chromosomale status van deze cellen behouden in cultuur.
Abstract
Hoewel de menselijke embryonale stamcellen (hESC) is aangetoond dat een stabiele diploïde karyotype 1 aanwezig is, hebben vele studies blijkt dat, afhankelijk van de kweekomstandigheden ze gevoelig zijn voor chromosomale afwijkingen zoals het toevoegen van geheel of delen van de chromosomen te verwerven. Inderdaad, tijdens langdurige cultuur, karyotypic veranderingen waargenomen als enzymatische of chemische dissociatie worden gebruikt 2,3,4, terwijl de handleiding dissectie van kolonies voor de passage behoudt een stabiele karyotype 5. Trouwens, veranderingen in de omgeving, zoals het verwijderen van feeder-cellen lijken ook de genetische integriteit van hESC 3,6 compromis. Zodra chromosomale veranderingen van invloed kunnen zijn cellulaire fysiologie, van cruciaal belang gezien hESC is het karakteriseren van de genetische integriteit van hESC in vitro als een essentieel instrument in de embryogenese studies en drugs testen. Verder is het voor de toekomstige therapeutische doeleinden chromosomale veranderingen zijn een echte zorg omdat het vaak is gekoppeld aan kanker.
Hier laten we een eenvoudige en handige methode om een hoge kwaliteit chromosoom spreads te verkrijgen voor verdere analyse van de chromosomen die door G-banding, FISH, lucht of de CGH technieken 7,8. Wij raden u aan de chromosomale-status routinematig met tussenpozen van vijf passages in om het uiterlijk van translocaties en aneuploïdieën te controleren
Priscila Britto en Rafaela Sartore droegen evenzeer voor het papier.
Protocol
APPARATUUR
- Weefselkweek incubator, 37 ° C, 5% CO 2
- Centrifuge
- Set van micropipettors (100, 100μL)
- Waterbad 37 ° C
- Waterbad 90 ° C tot bron van stoom water
- Fasecontrastmicroscoop
EERSTE STAP
Behandeling van de cellen met colcemid
In deze procedure hebben we de hESC lijn H9 gekweekt op muis embryonale fibroblasten (MEF) geïnactiveerd met mitomycine C (Sigma) en onderhouden DMEM/F12 (Invitrogen), aangevuld met 20% knock-out serum vervanging (KSR, Gibco) en 8ng/mL van fibroblast groeifactor (FGF-2, R & D).
Met het oog op een groot aantal metafasen spreads te verkrijgen, is het raadzaam om culturen te gebruiken met een hoge mitotische index, waarin er veel delende cellen.
- Neem de cultuur kolf van de incubator en in de laminaire stroming, voeg Colcemid bij een uiteindelijke concentratie van 0,1 ug / ml.
- Zet de kolf aan de incubator en wacht drie uur, zodat de remmer kan mitotische metafase arrestatie op, wanneer de chromosomen goed zijn gecondenseerd en kunnen gemakkelijk zichtbaar onder de microscoop te veroorzaken.
Bevestiging van de cellen
- Haal het medium en voeg tripsin / EDTA 0,05% voldoende is om de cellen bedekken. Laat cellen om incuberen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en vervolgens inactiveren van het enzym door het toevoegen van kweekmedium met serum of door simpelweg het toevoegen van serum naar de cellen.
OPMERKING: Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat een enkele cel suspensie is ontstaan om goede metafase spreads te verkrijgen. - Overdracht van de cellen om een 15 ml centrifugebuis en centrifugeer bij 122 g gedurende 5 minuten.
- Verwijder het supernatant, waardoor ongeveer 200 ml, en zachtjes resuspendeer de pellet door te tikken op de buis, zoals in de video. Zorg ervoor dat de cellen zijn goed gescheiden, dus je kunt niet visualiseren geen klonten in de oplossing.
- Vervolgens moet 5 ml van de hypotone oplossing (KCl 75mm) voorverwarmd tot 37 ° C, langzaam, door de buiswand als in de volgende beschrijving. Toevoegen Voeg eerst 3 ml, draai de buis in een horizontale positie alleen maar om de cellen dan mengen met de hypotone oplossing van de resterende 2 ml toe te voegen en warm te houden bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
NB: Op dit punt van de hypotone oplossing zal een verhoging van de cellulaire volume oorzaak en helpen om de chromosomen ontwarren. De tijd van incubatie is belangrijk om goede chromosoom spreads te verwerven. Als de timing te lang is, kan de cel membraan barsten te vroeg en de chromosomen zijn verloren. Als het te kort is, kan het moeilijk zijn om chromosoom verspreidt verkrijgen omdat de celmembraan kan niet verstoren. - Voeg 3 druppels van de oplossing fixatief (methanol / ijsazijn 3:1), voorzichtig omkeren de buis om het fixeermiddel oplossing te mengen met de cellen en centrifugeer bij 122 g gedurende 5 minuten zonder pauze.
OPMERKING: De fixatief oplossing moet vers worden gemaakt.
LET OP: Het is belangrijk om het centrifugeren te gebruiken zonder te breken naar de cellen natuurlijk verloop te vermijden, voorkomen van het verlies van het materiaal. - Verwijder het supernatant, waardoor ongeveer 200 ml, en zachtjes resuspendeer de pellet door te tikken op de bodem van de buis.
LET OP: Nogmaals, zorg ervoor dat de cellen zijn goed gescheiden, dus je kunt niet visualiseren geen klonten in de oplossing. - Voeg de eerste 3 ml fixatief oplossing, langzaam door de buiswand, terwijl je draait de buis. Keer de buis in een horizontale positie alleen maar om de cellen te mengen, en dan meer 2 ml van de oplossing fixeermiddel toe te voegen door de buiswand om de cellen neer te halen. Voorraad bij 4 ° C gedurende de nacht.
OPMERKING: De vaste cellen kunnen worden opgeslagen in fixeermiddel oplossing voor maanden bij 4 ° C. Naast het beschermen cellen in hun gezwollen toestand, het fixeermiddel oplossing verwijdert lipiden en proteïnen denatureert. Deze gebeurtenissen maken de celmembraan fragiel en, als gevolg daarvan, maken het chromosoom gemakkelijk verspreidt.
REINIGEN VAN DE objectglaasjes
Voordat u begint met het maken van uw chromosoom verspreidt zorg ervoor dat uw dia's goed zijn schoongemaakt of u kunt een aantal kernen te verliezen en ook metafasen. Deze stap is ook belangrijk als je wilt elke hybridisatie techniek 9 proberen.
- Plaats de glaasjes in een bekerglas met 6M HCl gedurende minstens 3 uur bij kamertemperatuur.
- Na deze tijd, wassen dia's in stromend water gedurende 10 minuten.
- Spoel de glaasjes in gedestilleerd water en laat ze drogen op kamertemperatuur.
- Nu is de dia's kunnen worden opgeslagen in 96% ethanol en gedroogd met een niet-pluizende direct voorafgaand aan gebruik.
OPMERKING: Voor in situ hybridisatie methoden, kan de dia's niet worden opgeslagen voor meer dan 2 dagen in 96% ethanol
TWEEDE STAP
Wassen van de cellen
- Op de volgende dagen, centrifuge de cellen bij 122 g gedurende 5 minuten zonder pauze.
- Discard het supernatant waardoor ongeveer 200 ml. Resuspendeer de pellet door zachtjes flicking de buis daarna langzaam 5 ml verse fixatief oplossing (methanol / ijsazijn 3:1) toe te voegen, door de buiswand, terwijl het draaien van de buis. Herhaal dit was nog 2 keer stap voor een totaal van drie wasbeurten.
OPMERKING: De fixatief oplossing moet vers worden gemaakt.
De voorbereiding van de dia's
- Bij de laatste centrifugatie stap laat voldoende hoeveelheid oplossing aan de cel pellet homogeniseren en het verkrijgen van een voldoende dichtheid van cellen in de dia's (zie figuur 1).
- Voeg 20 tot 30 ul van celsuspensie op een schone, droge dia door het verplaatsen van de pipet dicht en parallel aan het oppervlak. Als het fixeermiddel oplossing verdampt, het oppervlak van de slide wordt korrelig.
- Onmiddellijk bloot de dia, naar boven, in de stoom van heet water (90 °) gedurende 30 seconden om ertoe leiden dat de cellen op te blazen.
NB: Op dit moment is de methanol uit het fixeermiddel oplossing verdampt, wat resulteert in een verhoogde concentratie van azijnzuur, die samen met het water stimuleert de chromosoom verspreiden. - Kijk eens naar een fase contrast microscoop alleen om te controleren of de concentratie, alsook de cel distributie is goed (zie figuur 1).
- Nu de dia's staan klaar om gebruikt te worden om de set van chromosomen door de cytogenetica benaderingen als G-banding (Giemsa), vis, lucht of CGH te controleren.
BELANGRIJK TIPS
Hoe kiest u een geschikte metafase worden geanalyseerd
Het kiezen van ronde en geïsoleerde metafasen (figuur 2D), kan u vermijden overweegt valse aneuploïdieën als de winst van de chromosomen die door twee of meer verspreidt onderling vermengd of het verlies van chromosomen gegenereerd door een lanceerde chromosoom. Zo is, vermijdt het kiezen van metafasen de buurt van kernen, omdat sommige chromosomen kunnen worden verborgen door hen (figuur 2A en 2B). Trouwens, kijk voor ronde metafasen en zorg ervoor dat elk chromosoom is gescheiden van de metafase (figuur 2C).
Feeder cellen en de hESC karyotype
Voor G-banding en SKY-analyse, is de aanwezigheid van feeder-cellen in hESC cultuur niet bemoeien met de resultaten, omdat de feeder-cellen zijn niet onder een scheidslijn staat (geïnactiveerd door mitomycine C of bestraling) en zal geen deel uitmaken van de metafase bevolking. Echter, voor de toepassing van de FISH techniek in interfase kernen, verdient het de voorkeur om de bevolking te scheiden van hESC feeder cellen door het oogsten van de koloniën handmatig voordat trypsinisatie voor FISH-analyse.
Figuur 1: Hoe weet de juiste cel dichtheid in de dia's. Beelden van fase-contrast-microscoop in 10x doelstelling. (A) De cel dichtheid is te hoog. De pijlen wijzen naar spreads metafase te sluiten van de kernen. (B) is een glijbaan met een goede celdichtheid. De cirkels geven metafasen verspreidt zich geïsoleerd van kernen of andere metafasen. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 1 te zien.
Figuur 2: Hoe een adequate metafase worden geanalyseerd te kiezen. Chromosomen zijn gekleurd met DAPI en de beelden verkregen door een fluorescentiemicroscoop in 100x objectief. (A) (B) Vermijd metafasen de buurt van kernen (aangegeven door de pijlen) (C) en metafasen niet rond dat de huidige chromosomen gescheiden (cirkel). (D) Een ronde metafase is een goed metafase worden geanalyseerd. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 2 te zien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De voorbereiding van chromosoom spreads is een cruciale stap voor een succesvolle analyse van de genetische status van embryonale stamcellen door routinematig technieken zoals G-banding, en meer geavanceerde technieken zoals FISH, hemel en CGH.
Deze procedure kan worden toegepast voor veel soorten cellen door het variëren van de periode van colcemid incubatie, die afhankelijk is van de celcyclus lengte. Voor de kolonies van embryonale stamcellen, we wachten drie uur, terwijl voor embryoid instanties (EB) deze tijd kan worden tot 6 uur.
In het geval van het werken met cel-aggregaten (zoals embryoid lichamen) moet u zeer goed dissociëren om een enkele cel oplossing te verkrijgen. In dit geval, na trypsine en mechanische dissociatie, kunt u gebruik maken van een 40μm nylon cel zeef (BD Biosciences) en geef volgorde om de procedure (vanaf stap 4 van de procedures onderwerp).
In de hier beschreven procedure is het vermeldenswaardig dat de celsuspensie wordt "nauw" laten vallen op de dia's om te voorkomen dat grote verspreiding van de chromosomen en dus generatie van artefacten.
Wij zijn van mening dat dit protocol is een handig en eenvoudig hulpmiddel om routinematig niet alleen worden toegepast door laboratoria omgaan met embryonale stamcellen, maar door andere onderzoekers geïnteresseerd in het bestuderen van chromosomale instabiliteit in andere stamcellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml centrifuge tube | Techno Plastic Products | 91015 | |
| Colcemid Karyo MAX | GIBCO, by Life Technologies | 15212-012 | |
| EDTA | Isofar | 721 | |
| Glacial acetic acid | Isofar | 100 | |
| Methanol | Isofar | 208 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Merck & Co., Inc. | 104.931.000 | |
| Slide | Bioslide | 7105-1 | |
| Tripsin | Sigma-Aldrich | T4799 |
References
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1145 (1998).
- Draper, J. S. Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 22 (1), 53-53 (2004).
- Maitra, A. Genomic alterations in cultured human embryonic stem cells. Nat Genet. 37 (10), 1099-1099 (2005).
- Mitalipova, M. M. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 23 (1), 19-19 (2005).
- Buzzard, J. J., Gough, N. M., Crook, J. M., Colman, A. Karyotype of human ES cells during extended culture. Nat Biotechnol. 22 (4), 381-381 (2004).
- Caisander, G. Chromosomal integrity maintained in five human embryonic stem cell lines after prolonged in vitro culture. Chromosome Res. 14 (2), 131-131 (2006).
- Imreh, M. P. In vitro culture conditions favoring selection of chromosomal abnormalities in human ES cells. J Cell Biochem. 99 (2), 508-508 (2006).
- Robin-Wesselschmidt, J. L. Human Stem Cell Manual. Loring, J. F., Robin-Wesselschmidt, J. L., Robin-Wesselschmidt, S. chwartz , Elsevier's Science & Technology Rights. California. 59-59 (2007).
- Rooney, D. E. Human Cytogenetics. , Third Edition, Oxford University Press. (2001).
- Heslop-Harrison, P., Schwarzacher, T. Practical in situ hybridization. Heslop-Harrison, P., Schwarzacher, T. , BIOS Scientific Publishers. Oxford. 51-51 (2000).
