Summary
단백 분해 효소 형광 탐지 키트는 fluorometry를 사용하는 프로 테아제 활동의 측정을 위해 설계되었습니다. 그것은 또한 프로 테아제 오염 성분의 검출에 적합합니다. 방법은 FITC - 카제인 표시 기판의 독자적인 배합의 proteolytic hydroysis을 기반으로합니다.
Abstract
단백 분해 효소 형광 탐지 키트를 제공 즉시 사용 테아제 활동의 존재를 검출 시약합니다. 단백 분해 효소의 활동을 감지하는이 간단한 분석은 카제인 기판으로 플루오레신 isothiocyanate (FITC)로 표시합니다.
단백 분해 효소 활동 산성 조건 하에서 침전하지 작은 조각,로 FITC - 카제인 표시 기판의 절단을 초래합니다. 단백 분해 효소 샘플 및 기판의 부화 후, 반응은 trichloroacetic 산 (TCA)의 추가와 함께 산성이다. 혼합물은 다음 펠렛 및 솔루션에 남아있는 작은, 산성 수용성 조각을 형성 소화되지 않은 기판과 centrifuged 있습니다. 뜨는은 해소되고 FITC - 라벨 조각의 형광이 측정됩니다.
설명 키트 절차는 약 0.5 μg / ML (트립신의 5 NG 분석 추가)의 농도에 트립신 프로 테아제 컨트롤을 검색합니다. 이 감도는 최대 24 시간, 긴 배양 시간 증가 수 있습니다. 분석은 microcentrifuge 튜브에서 수행하고 절차 cuvettes 또는 multiwell 판을 사용하여 형광 검출을 위해 제공됩니다.
Protocol
준비 지침
부화 버퍼, 버퍼 분석 및 0.6 N TCA 솔루션은 즉시 사용 솔루션으로 제공합니다.
FITC - 카제인 기판은 - 그것은 반복 동결 - 해동주기를 피하기 위해 도착시 작은 볼륨으로 나누어지는 FITC - 카제인 기판을하는 것이 좋습니다. FITC - 카제인 기판이 반복 동결 - 해동주기를 받게되면, 백그라운드에서 약간 증가 감도를 낮추함으로써, 발생합니다. aliquots는 -20 ° C에 보관하고 빛으로부터 보호되어야합니다. 각 예제는, 공백, 또는 제어 반응은 FITC - 카제인 기판 20 μl가 필요합니다. 해동뿐만 아니라 활발한 혼합 또는 흔들림하면 FITC는 읽기와 더 적은 기판은 프로 테아제의 절단에 사용할 수로 인해 높은 배경에 발생하는 카제인에서 분리가 발생할 수 있습니다 / 프리즈.
플루오레신 isothiocyanate (FITC) 제어 솔루션 FITC 컨트롤을 적절한 농도로 분석 버퍼에 재구성 수 있습니다. 이 솔루션은 신선했고 빛으로부터 보호되어야합니다.
최종 트립신 제어 솔루션 - 트립신, 프로 테아제 제어 (제품 코드 T 6567)의 약병 1 MM HCL 100 μl를 추가합니다. 트립신이 해소되도록 간략하게 섞는다. 부화 버퍼 900 μl를 추가하고 잘 섞는다. 분석을 위해 필요한 경우 또는, 다른 버퍼를 사용할 수 있습니다. 트립신의 마지막 작업 농도는 20 μg / μl입니다. 때 트립신 제어 솔루션을 준비하는 준비 부화 버퍼 (9 부품 버퍼 1 부분 산성의 트립신)의 정확한 금액과 산성 트립신 솔루션의 나누어지는을 결합. 산성 조건 하에서 트립신을 저장하면 트립신의 안정성을 증가시킵니다. 트립신 제어 솔루션은 온도에 민감한하고 낮은 농도에서 안정되지 않습니다.
스토리지 및 이러한 준비 솔루션의 안정성을위한 키트의 기술 게시판을 참조하시기 바랍니다.
절차
- 한 번에 모든 컨트롤, 공백, 그리고 샘플을 준비하는 가장 쉬운 그것을 것입니다. 각 테스트 샘플의 경우, microcentrifuge 관을 배양 버퍼 20 μl, FITC - 카제인 기판 20 μl 및 테스트 샘플의 10 μl를 추가합니다. 높은 단백 분해 효소 활동과 테스트 샘플, 샘플 희석이 필요할 수 있습니다.
- microcentrifuge 관을 배양 버퍼, FITC - 카제인 기판 20 μl 및 제어 샘플 10 μl 20 μl를 추가하여 적절한 컨트롤 샘플 (컨트롤 샘플을 참조) 준비합니다.
- microcentrifuge 관을 배양 버퍼, FITC - 카제인 기판 20 μl, 그리고 ultrapure 물 10 μl 20 μl를 추가하여 빈 샘플을 준비합니다.
- 부드럽게 37 60 분 어둠 속에 ° C에서 각각의 튜브와 부화를 섞는다. 과도한 난류가 높은 형광 배경을 일으킬 수 있으므로, 너무 적극적으로 믹스 및 분석의 감도를 감소하지 않도록주의하십시오.
참고 : 배양 시간이 감도를 높이기 위해 최대 24 시간까지 연장할 수 있습니다. 높은 형광 배경에 이르는, FITC - 카제인이 저하될 시작 수 있으므로 24 시간 초과하지 않도록주의하십시오. - 부화 후 각 microcentrifuge 관에 0.6 N Trichloroacetic 산성 솔루션 150 μl를 추가합니다. TCA는 매우 부식성이고 적절한 보호 장비를 착용하는 동안 처리한다.
- 부드럽게 37 믹스와 부화 ° 30 분 동안 어둠 속에 C.
- 10,000 X G. 10 분 동안 튜브를 원심 분리기 뜨는은 염산 가용성, FITC 레이블 조각을 포함하고 형광 측정을 위해 사용됩니다.
형광 측정
이 방법은 최대 크기를 조절하거나 아래로 사용할 수있는 장비의 요구 사항에 따라 수 있습니다. 해당 컨트롤 샘플 준비 표준 곡선을 비교, 각 테스트 샘플의 값 (FLUtest)에서 빈 샘플 (FLUblank)의 형광 읽는 뺍니다.
Cuvettes
- 피펫 10 뜨는 (7 단계)와 적당한 쿠베트로 분석 완충액 1 ML의 μl 부드럽게 섞는다. 참고 : 최대 24 시간이 형광을 측정하기 전에를위한 뜨는 및 어세이 버퍼의 솔루션은 2-8 ° C에서 어둠에 저장되어있을 수 있습니다.
- 485 NM에서 여기로 형광 강도를 기록하고 535 nm의의 방출 파장을 모니터링.
Multiwell 플레이트
- 뜨는 (7 단계)와 적합한 튜브 또는 유리병에 분석 완충액 1 ML 부드럽게 혼합 참고 피펫 10 μl : 뜨는 및 어세이 버퍼의 솔루션은 최대 2-8 ° C에서 어둠에 저장되어있을 수 있습니다 형광을 측정하기 전에 24 시간.
- 블랙 96 잘 접시의 잘 200 μl를 전송합니다. 485 NM에서 여기로 형광 강도를 기록하고 535 nm의의 방출 파장을 모니터링.
또는
- 피펫 뜨는 2 μl (7 단계) 및 분석 B 200 μl블랙 96 잘 접시의 우물에 uffer. 참고 : 최대 24 시간이 형광을 측정하기 전에를위한 뜨는 및 어세이 버퍼의 솔루션은 2-8 ° C에서 어둠에 저장되어있을 수 있습니다.
- 485 NM에서 여기로 형광 강도를 기록하고 535 nm의의 방출 파장을 모니터링.
컨트롤 샘플
트립신 제어 솔루션은 분석은 검출 한계를 결정하거나, 일반적인 표준 곡선을 만들려면 제대로 실적을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 다른 특정 프로 테아제의 분석을 위해, 그것은 적절한 배양 버퍼에 특정 프로 테아제를 포함하는 제어 솔루션을 준비하는 것이 좋습니다.
분석의 검출 한계는 빈 샘플과 획득의 가치 위에 상당한 형광 독서를 생산 테아제의 금액입니다. 검색의 제한은 장비의 감도에 따라 달라집니다. 트립신 제어 솔루션의 직렬 dilutions는 컨트롤 솔루션을 생성하는 데 사용할 수 있습니다.
빈 샘플 얻은 값을 120 %로 읽는 동일가 중요한 것으로 간주됩니다. 일상적으로, 트립신 5 NG의 감지 한계는이 절차를 얻은 것입니다. 이것은 하나 이상의 다섯 NG 트립신 컨트롤이 각각의 분석으로 실행하는 것이 좋습니다. 0.5 μg / ML의 농도와 트립신 제어 솔루션은 분석에서 트립신의 원하는 5 NG가 발생할 것입니다. 트립신 제어 솔루션 (20 μg / ML) 0.5 μg / ML 제어 솔루션, 인큐베이션 버퍼 39 부분 트립신 제어 솔루션 즉, 한 부분의 결과를 40 배 희석.
그림 1 (트립신 활동의 표준 곡선) : 트립신 제어 솔루션 (20 μg / ML)도 (그림 1 참조) 시리얼 dilutions함으로써 표준 곡선을 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 각 컨트롤 샘플의 형광 읽기는 각 컨트롤 샘플 (FLUcontrol)의 가치에서 빈 샘플의 형광 읽기 (FLUblank)를 빼서에 의해 수정되었습니다.
이 키트 및 0.15 μg / ML (1.5 NG)에서 2.5 μg / ML (25 NG)에 이르기까지 컨트롤 샘플을 사용하여 트립신 (제품 번호 T 6567)에 대한 전형적인 표준 곡선. 이 곡선은 4 단계 30 분 배양 시간, 설명 절차에 따라 생성되었습니다. 형광 측정은 multiwell 접시에서 만들어졌다.
플루오레신 isothiocyanate가 가능한 계측기 교정에 대한 제어 (해당 제조 업체의 지침을 참조) 또는 FITC 신호의 선형성 범위의 결정으로 제공됩니다.
Discussion
우리는 단지 생물 학적 샘플의 단백 분해 효소의 활동을 감지하는 프로 테아제 형광 탐지 키트를 사용하여 예제 분석을 보여주었다. 이 키트는 생리 애플 리케이션에서 발견 프로 테아제의 다양한 범위를 감지하기 위해 최적화되었습니다. 그것은 세린, 시스테인, 금속 및 aspartic 프로 테아제의 검출에 적합하지만, 수정은 일부 특정 프로 테아제를 감지해야 할 수 있습니다.
Disclosures
저자는이 문서에서 사용하는 시약 및 도구를 만들어 시그마 알드리치의 직원입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease Fluorescent Detection Kit | Sigma-Aldrich | PF0100 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | H1758 |
References
- Twining, S. S. Fluorescein Isothiocyanate-Labeled Casein Assay for Proteolytic Enzymes. Anal. Biochem. 143, 30-34 (1984).
