Summary
Isolering av postimplantation steg embryon som gör att man kan studera gen mönstring och analysera cell-härstamning beslutsprocesser under fosterutvecklingen, men ordentlig dissekering av det tidiga embryot kan vara en utmaning. Detta protokoll beskriver en metod för att isolera tidiga primitiva-strimma steg embryon (~ 6,5 dagar efter coitum [DPC]).
Abstract
Analys av mönster genuttryck under tidiga stadier av däggdjurs embryonala utveckling kan ge viktiga ledtrådar om geners funktion, cell-cell interaktion och signalering mekanismer som styr embryonala mönster. Däremot kan dissekering av musen embryot från decidua kort efter implantation vara en utmanande förfarande och detaljerade steg-för-steg dokumentation av denna process saknas.
Här kan vi visa hur post-implantation (6,5 DPC) embryon som är isolerade genom att först dissekera livmodern av en gravid mus (detektion av vaginala kontakten utsågs dag 0,5 poist coitum) och därefter dissekera ett embryo från moderns decidua. Dissektion av Reichert membran beskrivs samt borttagning av ectoplacental konen.
Protocol
Dissekering av reproduktiva organ från en kvinnlig mus
- Gravida djur avlivas av CO 2 kvävning med komprimerad gas.
- Lägg djuret liggande på absorptionsdyna och dränk den i 70% etanol för att minska risken för kontaminering av dissektion med musen hår.
- Nyp ihop huden och gör en liten laterala snitt vid mittlinjen med vanlig kirurgisk sax. Håll huden ordentligt över och under snittet och dra i huden isär mot huvud och svans för att avslöja buken.
- Ta tag i bukhinnan med pincett och skär avslöja bukhålan.
- Leta reda på fortplantningsorganen i dorsala region av kroppen hålrum: två livmoder horn eller äggledare och äggstockar.
Primitivstrimman steg (6,5 DPC) Dissection
- Ta bort livmodern horn genom att ta tag i livmodern under äggledare och skär den fria längs mesometrium. Placera dissekerade livmodern i iskallt PBS.
Figur 1 - Separera varje embryo genom att klippa mellan implantationsställen längs uterin horn.
Figur 2 - Ta tag i muskulösa livmoderslemhinnan genom att skjuta urmakare pincetten mellan den omgivande muskler lagret och insvept decidua vävnad. Dra av muskel lagret, exponera decidua.
Figur 3 - Klipp bort en del av den exponerade decidua i toppen (ca 1 / 5 av de decidua vävnad) som kommer att utsätta den midventral eller distala toppen av den medföljande embryot.
Figur 4 - Embryot kan skalade ut med hjälp av tips av peang. Stick hål på decidua med pincetten kring embryot och öppna pincett att riva decidua isär.
Figur 5 - När embryot är borttagen, kan Reichart membran fortfarande bifogas liksom ectoplacental konen (trofoblaster). Embryot kan dissekeras ytterligare genom noggrann dissektion.
Figur 6
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Postimplantation hos mus sker mellan 4,5 DPC och födelse. Denna dissektion metod kan tillämpas i huvudsak enligt beskrivningen, att isolera tidigare eller senare skede embryon på 5,5-8,5 DPC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Dissecting Forceps serrated, straight | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5130 | 2 pairs |
| Micro Dissecting Tweezers Pattern #55 INOX | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5010 | 2 pairs |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1x) | Reagent | Invitrogen | 14190 | |
| Fisherbrand Sterile Polysytrene Petri Dish | Tool | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Reagent | |||
| Straight Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Tool | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Pregnant female mice | Animal | |||
| Dissecting Microscope | Microscope |
References
- Nagy, A., et al. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual third edition. , Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. (2003).
