Visualizzazione RNA localizzazione in Xenopus Gli oociti

Sommario

Visualizzazione di In vivo RNA di trasporto si ottiene microiniezione di fluorescente trascrizioni di RNA in Xenopus Ovociti, seguito dalla microscopia confocale.

Abstract

Localizzazione dell'RNA è un meccanismo conservato di stabilire la polarità delle cellule. Vg1 mRNA localizza al polo vegetale ovociti di Xenopus laevis e atti a limitare spazialmente l'espressione genica di VG1 proteine. Stretto controllo VG1 distribuzione in questo modo è richiesto per l'indicazione corretta foglietto embrionale di un embrione in via di sviluppo. Elementi di sequenza di RNA nel 3 'UTR del mRNA, il VG1 elemento di localizzazione (VLE) sono necessari e sufficienti per trasporto diretto. Per studiare il riconoscimento e il trasporto del VG1 mRNA in vivo, abbiamo sviluppato una tecnica di imaging che permette un'analisi approfondita dei trans-fattore di meccanismi di trasporto diretto attraverso una semplice lettura visiva.

Per visualizzare la localizzazione di RNA, che sintetizzano fluorescente RNA VLE e microinject questa trascrizione in ovociti individuali. Dopo la cultura degli ovociti per consentire il trasporto del RNA iniettato, gli ovociti vengono fissate e disidratate prima di imaging, microscopia confocale. Visualizzazione di modelli di localizzazione mRNA fornisce una lettura per il monitoraggio del percorso completo di RNA di trasporto e per l'individuazione dei ruoli nel dirigere l'RNA di trasporto per cis-acting elementi all'interno della trascrizione e trans-acting fattori che si legano al VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). Abbiamo esteso questa tecnica attraverso la co-localizzazione di RNA e proteine ​​addizionali (Gagnon e Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), e in combinazione con la rottura del motore e di proteine ​​del citoscheletro (Messitt et al., 2008) di sondare meccanismi alla base di localizzazione mRNA.

Protocollo

Parte 1: Trascrizione di mRNA fluorescente.

1. Linearizzare DNA plasmidico contenente l'elemento di localizzazione di RNA o altre sequenze pertinenti e risospendere a 1 mg / mL con DEPC trattati con H ₂ O. Il modello di DNA deve avere siti promotore a monte per la trascrizione da T7, SP6, o T3 RNA polimerasi.
2. Aggiungere i seguenti reagenti in una provetta sterile 1,5 ml:

   a. Tx tampone 10X (vedi M & M)	2 microlitri
   b. 20X tappo / NTP mix (vedi M & M)	1 ml
   c. 1 mM Alexa Fluor 546-14-UTP (Invitrogen)	1 ml
   d. UTP, [α-32 P] ....

Discussione

Qui abbiamo presentato un protocollo per visualizzare la localizzazione mRNA in ovociti di Xenopus. Questo metodo, utilizzando fluorescente trascrizioni di RNA è più alto rapporto segnale-rumore di quanto precedentemente ottenuti con marcati con digossigenina trascrizioni ed è più semplice e più veloce di approcci basati in situ (Mowry e Melton, 1992, Gautreau et al., 1997). Utilizzando questo metodo, possiamo progettare mutazioni sequenza di RNA e rapidamente test per funzione in vivo. Inoltre, utiliz.......

Materiali

Tx tampone 10X

• 60 mM MgCl ₂
• 400 mM Tris-HCl (pH 7,5)
• 20 mM spermidina-HCl

20x cap / NTP mix

• 10 mM CTP
• 10 mM ATP
• 9 mm UTP
• 2 mM GTP
• 20 mM G (ppp) G Cap analogico (New England Biolabs)

G-50 colonna

• Idrato 5 g Sephadex G-50 perle (Sigma Aldrich) in 100 ml di acqua deionizzata H ₂ O. DEPC-treat per 30 min. e autoclave. Conservare magazzino incompleto a temperatura ambiente. Prima dell'uso, aggiungere il seguente RNasi-free soluzioni:
• 0,5 ml 0,2 M EDTA
• 1 ml 1 M Tris pH 8.0
• 0,5 ml 20% SDS
• Conservare completa soluzione G-50 a 4 ° C.
• Rimuovere e gettare lo stantuffo da una siringa da 3 ml (BD Biosciences) e posizionare il cilindro della siringa in un tubo da 15 ml (Corning). Collegare la siringa con una piccola quantità di lana di vetro (un tappo circa la metà delle dimensioni di un centesimo).
• Swirl completo G-50 soluzione per risospendere le sfere.
• Aggiungere 2 ml di soluzione G-50 alla colonna vuota.
• Spin per 1 minuto a 1.000 x g in centrifuga da banco.
• Aggiungere 200 ul DEPC trattati deionizzata H ₂ O per ogni colonna. Spin.
• Ripetere il lavaggio altre due volte per un totale di tre lavaggi.
• Rimuovere il corpo della siringa per un nuovo tubo 15 ml.

Collagenasi soluzione

• 75 mg di collagenasi da Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich)
• 25 ml 0,1 M KPO ₃ + (pH 7,4)

MBSH tampone

• 88 mm NaCl
• 1 mM KCl
• 2,4 mM NaHCO ₃
• 0,82 mM MgSO ₄ x 7H ₂ O
• 0,33 mm Ca (NO _{3) 2} x 4H ₂ O
• 0,41 mM CaCl ₂ X 6H ₂ O
• HEPES 10 mM (pH 7,6)

Ovocita Cultura Media

• 50% di media L15
• HEPES 15 mM (pH 7,6)
• 1 mg / ml di insulina
• 100 mg / ml di gentamicina
• 50 U / ml nistatina
• 50 U / ml di penicillina
• 50 mg / ml di streptomicina

MEMFA soluzione

• MOPS 0,1 M (pH 7,4)
• 2 mM EGTA
• 1 mM MgSO ₄
• 3,7% di formaldeide

Computing RNA resa

• Determinare CPM in "input" e "incorporato" campioni utilizzando un normale contatore a scintillazione.
• incorporazione = ("integrato") / (10 x "input")
• I valori tipici compresi tra incorporazione ~ 0,03 e 0,10.
• Tenore massimo teorico per polimerasi diverse:
  T7, T3, SP6 - 2,64 mg
• Resa di reazione in mg = (resa massima di polimerasi utilizzato) X (incorporazione)
• Diluire RNA a 50 Nm = (mg RNA) / 320 / (lunghezza di RNA nelle basi) / (5X10 ^-8)
• La reazione solitamente produce ~ 50-100 ml di RNA di 50 nm.