Визуализация РНК Локализация в Xenopus Ооцитов

Краткое содержание

Визуализация В естественных условиях РНК транспорта осуществляется путем микроинъекции флуоресцентно меченных транскриптов РНК в Xenopus Ооцитов, а затем с помощью конфокальной микроскопии.

Аннотация

РНК локализация сохраняется механизм формирования клеточной полярности. Vg1 мРНК локализуется на растительном полюса Xenopus laevis ооциты и действует на пространственно ограничить экспрессии генов Vg1 белка. Жесткий контроль Vg1 распределение таким образом, необходимо для правильного выбора слой зародыша в развивающемся эмбрионе. РНК последовательности элементов в 3 'UTR мРНК, Vg1 локализации элемента (VLE) необходимы и достаточны для прямого транспорта. Для изучения признание и транспортировки Vg1 мРНК в естественных условиях, мы разработали изображений метод, который позволяет обширный анализ транс-фактора направлено транспортных механизмов с помощью простого визуального считывания.

Чтобы визуализировать локализацию РНК, мы синтезировать флуоресцентно меченных VLE РНК и microinject эту стенограмму в отдельные ооциты. После ооцитов культуры, чтобы перевозки вводили РНК, ооциты являются фиксированными и обезвоженные до визуализации с помощью конфокальной микроскопии. Визуализация модели локализации мРНК обеспечивает считывание для мониторинга полный путь РНК транспорта и для выявления роли в управлении РНК транспорта для цис-действующих элементов в стенограмме и транс-действующих факторов, которые связываются с VLE (Lewis и соавт., 2008, Messitt и соавт., 2008). Мы расширили эту технику в рамках совместного с дополнительной локализации РНК и белков (Ганьон и Моури, 2009, Messitt и соавт., 2008), а в сочетании с нарушением моторных белков и цитоскелет (Messitt и соавт., 2008), чтобы исследовать механизмы, лежащие мРНК локализации.

Протокол

Часть 1: Транскрипция флуоресцентно меченных мРНК.

1. Линеаризации плазмиды ДНК, содержащей элемент РНК локализации или другие соответствующие последовательности и ресуспендирования на 1 мкг / мкл DEPC обработанных H ₂ O. ДНК шаблоне должен быть выше по течению сайтов промотор для транскрипции Т7, SP6, или T3 РНК-полимеразы.
2. Добавить следующие реагенты для стерильного 1,5 мл трубки:

   a. 10X Tx буфере (см. М & М)	2 мкл
   b. 20X шапка / NTP смеси (см. М & М)	1 мкл
   c. 1 мМ Alexa Fluor 546-14-UTP (Invitrogen)	1 мкл
   d. UTP, [α-32

Обсуждение

Здесь мы представили протокол для визуализации локализации мРНК в ооцитах Xenopus. Этот метод, с помощью флуоресцентно меченных РНК-транскрипты имеет более высокое отношение сигнал-шум, чем ранее полученные с дигоксигенин меченных стенограммы и проще, и быстрее, чем на месте подход (Моури и Мелтон, 1992, Гаутро и соавт., 1997). Используя этот метод, мы можем инженер РНК последовательности мутаций и быстрого теста для прижизненного функции. Кроме того, с помощью дополнительных Alexa-UTP флуорофоров, нес.......

Материалы

10X буфера Tx

• 60 мМ MgCl ₂
• 400 мМ Трис-HCl (рН 7,5)
• 20 мМ спермидина-HCl

20x шапка / NTP смеси

• 10 мМ CTP
• 10 мМ ATP
• 9 мм UTP
• 2 мМ GTP
• 20 мМ G (ППС) G Cap аналоговый (New England Biolabs)

G-50 колонке

• Гидратов 5 г Сефадекс G-50 бусин (Sigma Aldrich) в 100 мл деионизированной H ₂ O. DEPC лечению в течение 30 мин. и автоклав. Магазин неполный запас при комнатной температуре. Перед употреблением добавить следующие РНКазы без решения:
• 0,5 мл 0,2 М ЭДТА
• 1 мл 1 М Трис рН 8,0
• 0,5 мл 20% SDS
• Магазин полный G-50 решение при 4 ° C.
• Удаляют поршень от 3 мл шприцем (BD Biosciences) и поместите баррель шприца в 15 мл коническую трубку (Corning). Вставьте шприц с небольшим количеством стекловаты (плагин около половины размера копейки).
• Swirl полный G-50 решение для ресуспендирования бисером.
• Добавить 2 мл G-50 решение пустой столбец.
• Спиновые течение 1 минуты при 1000 х г в центрифуге настольный.
• Добавить 200 мкл DEPC обработанных деионизированной H ₂ O для каждого столбца. Spin.
• Повторите мыть два раза больше, в общей сложности три стирок.
• Удалите шприц баррель до 15 мл свежего коническую трубку.

Коллагеназа решение

• 75 мг коллагеназы из Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich)
• 25 мл 0,1 М КПО ₃ + (рН 7,4)

MBSH буфер

• 88 мМ NaCl
• 1 мМ KCl
• 2,4 мМ NaHCO ₃
• 0,82 мМ MgSO _{4 x} 7H ₂ O
• 0,33 мМ Ca (NO _{3) 2} X 4H ₂ O
• 0,41 мМ CaCl ₂ х 6H ₂ O
• 10 мМ HEPES (рН 7,6)

Средний ооцитов культуры

• 50% L15 среда
• 15 мМ HEPES (рН 7,6)
• 1 мг / мл инсулина
• 100 мг / мл гентамицина
• 50 ед / мл нистатина
• 50 ед / мл пенициллина
• 50 мг / мл стрептомицина

MEMFA решение

• 0,1 М MOPS (рН 7,4)
• 2 мМ EGTA
• 1 мМ MgSO ₄
• 3,7% формальдегида

Вычислительная РНК выход

• Определите CPM в "вход" и "включить" образцы с использованием стандартного сцинтилляционного счетчика.
• Включение = ("включено") / (10 х "вход")
• Типичные значения включению в диапазоне от ~ 0,03 и 0,10.
• Максимальная теоретическая доходность для разных полимераз:
  T7, T3, SP6 - 2,64 мкг
• Реакция выхода в мкг = (максимальный выход полимеразы используется) X (включение)
• Развести РНК до 50 нм = (мкг РНК) / 320 / (длина РНК в базах) / (5x10 ^-8)
• Реакция обычно дает ~ 50-100 мкл РНК на 50 нм.