Summary
Optokinetische reactie is op grote schaal gebruikt om de visuele functies van larvale zebravis te beoordelen. Toch is het standaard protocol voor larvale vis is nog niet goed toepasbaar bij volwassenen
Abstract
Optokinetische respons (OKR) is een gedrag dat een dier trilt de ogen voor een roterende rooster te volgen omheen. Het is op grote schaal gebruikt om de visuele functies van larvale zebravis 1-5 te beoordelen. Toch is het standaard protocol voor larvale vis is nog niet goed toepasbaar bij volwassen zabrafish. Hier introduceren we hoe de OKR van volwassen zebravissen meten met onze eenvoudige custom-built waarbij gebruik wordt gemaakt van een nieuwe protocol dat is gevestigd in ons lab. Zowel onze apparatuur en stap-voor-stap procedure van de OKR bij volwassen zebravissen worden geïllustreerd in deze video. Daarnaast worden de metingen van de larven OKR, evenals de optomotor respons (OMR) test van volwassen zebravissen, toonde ook in deze video. Dit OKR test van volwassen zebravissen in ons experiment kan duren tot 4 uur. Dergelijke OKR-test toegepast bij volwassen vissen ten goede komt aan de visuele functie onderzoek efficiënter wanneer de volwassen vis vision systeem is gemanipuleerd.
Su-Qi Zou en Wu Yin droegen ook aan deze krant.
Protocol
Deel I: Construeer de OKR apparaat
Details zijn weergegeven in video demonstratie.
Deel II: OKR van Adult zebravis
Als uw lab heeft gebouwd een OKR apparaat, de sleutel van de volwassen zebravissen OKR is om vast te houden de vis. In dit deel zullen we tonen u stap voor stap.
Onze apparaten componeert volgende onderdelen vergelijkbaar met genoemde anderen. De ronde vis kamer is 7,0 cm in diameter, 6,5 cm in de inwendige diameter en 7,0 cm in hoogte. De trommel rond vis kamer is 8,5 cm in out diameter, 7,5 cm in de inwendige diameter en 7,0 cm in hoogte. Het kan draaien met de klok mee en tegen de klok met de snelheid van 20 ~ 70 rotaties per minuut (rpm). Elf cycli van zwarte en witte strepen getekend op een transparant papier, die toegetreden op de buitenkant van de trommel. Het licht systeem is samengesteld uit twee cirkel licht buizen in 21 cm diameter.
Figuur 1. Het model van spons. De rots in dit midden is om ervoor te zorgen dat het visuele veld niet werd beschermd.
- Een spons zoals weergegeven in Fig.1 gecomponeerd door twee delen. Het linker deel is lengte 3 cm x breedte 3 cm x 2 cm hoog. Het rechter deel is in de lengte 3 cm x breedte 3 cm x 3 cm hoog.
- Zet dit spons in de bodem van vis kamer en giet water in fokken ongeveer 2 cm diepte. Luchtbel die te verbergen in de spons moet worden verdreven.
- Steek een pin in de voorzijde van rechter deel van spons, ongeveer 2 mm achter de klif.
- Verdoven een volwassen zebravissen in MS-222.
- Zet de zebravis op de spons met een dorsale omhoog en laat de ene kant van de borstvin voor de eerste pin.
- De tweede pen wordt ingestoken achter de andere borstvin. Het kan voorkomen dat zebravis krimpen lichaam door samen te werken met de eerste pin (zie ook de in Fig. 2).
- Klem zijn staart met een slagader klem en de slagader klem vast te stellen in een stuk rubber (boetseerklei), die is aangehouden op de vis kamer.
- De derde en vierde pin is geplant in de site in de buurt cloaca porie van vis lichaam. Het kan voorkomen dat zebravis aan zijn staart intens golf.
- De vijfde pin is gelegen tussen de eerste en de derde pin en dan de zesde pin aan de andere kant ervan. Zij konden voorkomen dat zebravis uit zijn lichaam te schudden.
- De zevende en achtste pen wordt ingestoken in de locaties in de buurt van de kieuwen aan het hoofd richting te houden.
- Giet opvoeding water in de vis kamer.
- Na de zebravis wakker wordt, laat het aan te passen voor 5 ~ 10 minuten.
- Schakel het licht van dit apparaat en laat zebravis deze verlichting aan te passen voor 2 minuten.
- Schakelaar op de motor op de rooster rijden en zebravis aan te passen gedurende 1 minuut mogelijk te maken.
- Zet de camera aan en neem de beweging van de ogen.
- Analyseer het oog hoeken 6 en saccade nummers op uw personal computer (Een representatief voorbeeld van het oog hoeken analyse is weergegeven in figuur 2).
Figuur 2. De hoek tussen het oog as en body as.
a) Wanneer de richting van de rooster is neus-aan-temporele, definieerden we de hoek op de voorsprong van de vis lichaam is een negatieve hoek en de hoek van de vis lichaam is een positieve hoek, vice versa (voor het kort overzicht zie ook Ref. 6). Getallen in deze figuur geven de volgorde van de pinnen.
b) OKR analyse voorbeeld uit een vis in de normale groep. Een een-tweede film werd overgebracht naar een serie frames en het oog hoeken van elk frame werd gemeten met Image-Pro Plus software. Elk punt in deze figuur geeft elk frame we gemeten.
Opmerkingen:
- Alle pinnen zijn slechts gebruikt om zebravis voorkomen dat zijn lichaam te schudden, te strak zal zijn schadelijk voor vissen.
- Slagader klem kan schade aan de staart als het contactoppervlak is klein. Zodra de staart is vrij, het is erg moeilijk op te lossen deze vis. Wikkel een bandage rond de staart wordt aanbevolen in een bepaalde voorwaarde.
- De zevende en achtste pin, die worden geplant in de site in de buurt van kieuw mag niet worden beschutting van hun uit het oog rooster.
Deel III. OKR van larvale zebravis
1. Methylcellulose
Larvale zebravissen kunnen worden geïmmobiliseerd in 6% methylcellulose-oplossing, terwijl in leven te houden voor een lange tijd. Bereid methylcellulose-oplossing als volgt.
- Kook 200 ml DDH 2 O in de magnetron oven ongeveer 3 minuten op hoog niveau.
- Breng de warm water aan een roerend kookplaat en krachtig roeren.
- Voeg 12 g methylcellulose in het hete water geleidelijk.
- Blijf roeren gedurende 3 minuten na methylcellulose is goed verspreid.
- Koel de oplossingen met ijswater totdat het duidelijk wordt, en dan plaats bij 4 ° C.
- Paren twee mannelijke en een vrouwelijke van volwassen zebravis in een paring tank om 17.00 uur na de voeding. De volgende ochtend overbrengen naar een nieuwe paring tank en het verzamelen van embryo's na 1 uur.
- De eieren worden gehandhaafd in embryo medium in een 28,5 ± 0,5 ° C incubator met het licht: donker cyclus van 14:10.
- Eieren worden uitgebroed op 48 uur na de bevruchting (HPF) en de OKR zal worden getest bij 72 HPF of later. In deze video, de larven zijn op 5 DPF.
3. Procedure van de OKR
- Zet het apparaat onder de stereoscoop uitgerust met een CCD-camera en schakel het licht van dit apparaat.
- Voeg 20 ml 6% methycellulose in een 55-mm petrischaal.
- Plaats een aantal larven in een rij in het midden van dit gerecht.
- Zet een luchtbel over een volume van 1 ui in de camera gebied, kan het als een spiegel om de richting van het rooster weer te geven.
- Schakelaar op de motor en noteer de beweging van hun ogen.
Deel IV. OMR van Adult zebravis
Volwassen zebravissen OMR kan ook worden uitgevoerd met dit apparaat, plaatst een kolom in de vis kamer voor het voorkomen van vissen zwemmen in het centrum (toonde in Fig.3a, roterende snelheid is 36 rpm, zwart-wit cycli 11).
- Zet een vis in deze vis kamer.
- Staan een kolom van 2 cm diameter in het midden van deze vis kamer.
- Aan te passen voor een minuut, zowel in nog raspen en rotatie raspen.
- Registreren de beweging van de zebravis.
- Analyseer het samenvallen snelheid van tijd op uw personal computer (een voorbeeld is te zien in Fig.3b, roterende snelheid is 36 rpm, zwart-wit-cyclus is 11)
Figuur 3. OMR van Adult zebravis. (A) Een witte kunststof column werd geplaatst in het centrum van de vis kamer voor het voorkomen van vissen zwemmen over heen. (B) Het samenvallen percentage van de volwassen zebravissen na het rooster. Het toeval werd gedefinieerd als de verhouding van de volgende rooster tijd om de totale opnametijd. De waarde van 50% geeft aan dat de vis willekeurig is zwemmen, terwijl 100% geeft aan dat de vis volgende rooster erg goed. Beide oogzenuwen waren verpletterd met een tang sieraden ongeveer 10 seconden. Het gedrag van OMR verscheen als een willekeurige zwemmen na het verpletteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Volgens de definitie van het OKR, het is een fenomeen dat dieren hun ogen te verplaatsen naar een roterend rooster spontaan na te streven. Als dit gedrag is uitgevoerd voor een lange tijd (bijv. meer dan 6 uur), kan de oogspieren worden moe en de OKR zal worden verzwakt.
Volwassen zebravissen OMR is volledig beschreven door anderen 7. In deze video, we laten u dit gedrag met onze apparatuur. Zodra de oogzenuwen worden geplet, konden ze niet volgen dit rooster heel goed.
Wij hebben OKR gedrag te testen in volwassen, larven zebravis en OMR bij volwassenen met onze eenvoudige custom-built apparatuur om de visuele functie van de zebravis te evalueren. Dit OKR test van volwassen zebravissen in ons experiment zou sterk genoeg te houden binnen een periode van 4 uur zonder te schaden. Dit kan openen OKR te testen in volwassen vissen functie bestuderen efficiënter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij danken mevrouw Fan Shen voor haar steun aan de zebravis opvoeding. Dit wordt ondersteund door oraties aan dr. Bing Hu (Chinese Academie van Wetenschappen, "Bai Ren Ji Hua", NSFC 30870833 en National Basic Science Program van China, 2009CB941302).
Alle dierlijke experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door de Universiteit voor Wetenschap en Technologie van China (USTC) Animal Resources Center en de University Dierverzorging en gebruik Comite.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M6385 | Viscosity 25 cP |
References
- Beck, J., Gilland, E., Tank, D., Baker, R. Quantifying the Ontogeny of Optokinetic and Vestibuloocular Behaviors in Zebrafish Medaka, and Goldfish. J Neurophysiol. 92, 3546-3561 (2004).
- Brockerhoff, S. Measuring the optokinetic response of zebrafish larvae. Nature Protocols. 1, 2448-2451 (2006).
- Emran, F. OFF ganglion cells cannot drive the optokinetic reflex in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 19126-19131 (2007).
- Rinner, O., Rick, J., Neuhauss, S. Contrast Sensitivity, Spatial and Temporal Tuning of the Larval Zebrafish Optokinetic Response. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 46, 137-142 (2005).
- Roeser, T., Baier, H. Visuomotor Behaviors in Larval Zebrafish after GFP-Guided Laser Ablation of the Optic Tectum. The Journal of Neuroscience. 23, 3726-3734 (2003).
- Easter, S., Nicola, G. The Development of Vision in the Zebrafish (Danio rerio). Developmental Biology. 180, 646-663 (1996).
- Maaswinkel, H., Li, L. Spatio-temporal frequency characteristics of the optomotor response in zebrafish. Vision Research. 43, 21-30 (2003).
