쥐 MSCS는 대퇴골과 tibias으로부터 격리하고 자기 세포 분류에 의해 풍부하게되었다. 정렬 세포 유동세포계측법에 의해 표면 마커의 표현에 대해 확인했다. 이러한 세포는 하나의 식민지를 형성 clonal 밀도에 교양 있었다 그리고 이들 식민지는 복제 실린더로 구분했다.
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방법 논문
분리 및 랫 Mesenchymal 줄기 세포의 농축 (MSCS)와 MSCS를 유래 단일 식민지의 분리
이 논문에서
요약
초록
MSCS는 치료 어플 리케이션을위한 유망한 원천이다 성인 줄기 세포의 인구입니다. 이러한 세포는 골수에서 격리 수 있으며, 쉽게 플라스틱 준수로 인해 조혈 줄기 세포 (HSCs)에서 분리될 수있다. 이 프로토콜은 쥐 대퇴골과 tibias에서 MSCS를 분리하는 방법에 대해 설명합니다. 분리된 세포는 더욱 자기 셀 정렬하여 두 MSCS 표면 마커 CD54과 CD90에 대한 풍부한되었습니다. 표면 마커 CD54과 CD90의 표현은 다음 유동세포계측법 분석에 의해 확인되었다. HSC 마커 CD45도 정렬 MSCS가 HSCs의 소진되었습니다 있는지 확인하기 위해 포함되었습니다. MSCS 자연 매우 이질 있습니다. 다른 형태, 증식 및 분화 능력을 가지고 세포의 subpopulations가 있습니다. 이러한 subpopulations는 모든 알려진 MSCS의 마커를 표현하고 더 독특한 마커는 아직 다른 subpopulations에 대한 확인되지 않았습니다. 따라서, 다른 subpopulations을 분리하는 대체 방법은 단일 식민지 파생 세포를 분리하는 복제 실린더를 사용하고 있습니다. 단일 식민지에서 파생된 세포는 다음 교양하고 별도로 평가하실 수 있습니다.
프로토콜
1. 쥐 MSCS의 분리
Mesenchymal 줄기 세포는 이전에 다음 ID로 한 설명된대로 6-8주 오래된 스프 라그 - 돌리 좋아하지, 2 고립되었다. 절연 MSCS 플라스틱 표면을 준수하고 쉽게 체외 문화 중에 확장할 수 있습니다.
- 동물은 마취 챔버에 넣고 약 5 분 동안 anaesthetized했다. 마취 동안, 점멸, 호흡 및 운동 활동의 속도를 관찰합니다. 그것이 모터의 활동을 중지하고 깜빡 속도가 드문가 된 후 즉시 챔버에서 동물을 제거합니다.
- 작업 역에있는 동물을 버리고, 경추 전위에 의해 동물을 죽이지. 다시 사지에서 대퇴골과 tibias 잘라, 피부와 근육을 제거하십시오.
- 몇 초 동안 이소프로판올 70%에서 해부하는 대퇴골과 tibias를 넣고 1X D - PBS로 전송할 수 있습니다.
- biosafety 캐비닛에서 대퇴골과 tibias는 DMEM을 포함 10cm 요리로 전송되었습니다. 각 뼈가 다음 핀셋 개최되었고 두 끝을는 가위로 잘라 오픈되었습니다. 3ml 주사기에 22G 바늘을 첨부하여 DMEM로 작성 후 뼈 중 하나 열 끝에 바늘을 삽입하여 50ml 튜브에 골수를 플러시. ~ 3 번 각각의 뼈에 반복 2....
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토론
이 프로토콜은 격리와 MSCS를 풍요롭게하는 방법에 대해 설명합니다. 단일 식민지 파생 세포를 분리하는 방법도 포함될 수 있습니다. 성공적인 고립, 농축 및 식민지 분리에 중요한 몇 가지 단계가 있습니다. 쥐의 세포에서 분리하고 있지만, 그것은 셀 스트레이너 또는 혈전과 뼈 파편 제거와 비슷한 크기의 살균 나일론 메쉬를 통해 필터 권장합니다. 하룻밤 세포를 도금 후, 많은 죽은 세포는 매체 부동되고 죽은 세포가 부착된 세포의 성장을 도움이 될 것입니다 새로운 매체로 대체하여 제거됩니다.
이 프로토콜의 정렬 자기 세포는 긍정적인 선택을 수행하는 방법을 설명하고, 이와 유사한 절차는 부정적인 선택을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 추가되는 항체의 양이 다를 수 있으며 최적화는 더 나은 정렬을 달성하기 위해 필요합니다. 이것은 유동세포계측법 분석을 위해 세포를 라벨에도 적용됩니다. 바로 라벨 샘플 유동세포계측법 분석을 실행하지 않는 경우, 샘플은 2 %의 포름 알데히드와 고정하고.......
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감사의 글
작품은 보건 국립 연구소 (R01GM079688, R21RR024439 및 R21GM075838), 국립 과학 재단 (CBET 0,941,055) 및 MSU 재단 일부 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1X D-PBS | Invitrogen | 14040-133 | |
| DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
| 셀 스트레이너 | BD Biosciences | 352350 | |
| FBS | Invitrogen | 26140-079 | |
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| BD Imagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| Biotin mouse IgG2a | BD Biosciences | 555572 | |
| Biotin mouse IgG1 | BD Biosciences | 555747 | |
| Biotin anti-rat CD54 | Cedarlane Labs | CL054B | |
| Biotin anti-rat CD90 | Cedarlane Labs | CL005B | |
| Biotin anti-rat CD45 | Cedarlane Labs | CL001B | |
| BD Imag 완충액 | BD Biosciences | 552362 | |
| 라운드 바텀 튜브 | BD Biosciences | 352063 | |
| Streptavidin 입자 | BD Biosciences | 557812 | |
| SA-PE | R&D Systems | F0040 | |
| 클로닝 실린더 | Sigma-Aldrich | C2059 |
참고문헌
- de Hemptinne, I., Vermeiren, C., Maloteaux, J. M., Hermans, E. Induction of glial glutamate transporters in adult mesenchymal stem cells. J Neurochem. 91, 155-166 (2004).
- Porter, R. M., Huckle, W. R., Goldstein, A. S. Effect of dexamethasone withdr....
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재인쇄 및 허가
