Summary
Ratto MSC sono stati isolati da femori e delle tibie e poi arricchita da cell sorting magnetico. Cellule ordinati sono stati confermati per l'espressione di marcatori di superficie mediante citometria a flusso. Queste cellule sono state coltivate a densità clonale a formare singole colonie e poi queste colonie erano separate da cilindri di clonazione.
Abstract
Le MSC sono una popolazione di cellule staminali adulte che è una fonte promettente per applicazioni terapeutiche. Queste cellule possono essere isolate dal midollo osseo e può essere facilmente separato dalle cellule staminali ematopoietiche (HSC) a causa della loro adesione plastica. Questo protocollo descrive come isolare cellule staminali mesenchimali di topo femori e tibie. Le cellule isolate sono state ulteriormente arricchite contro due marcatori di superficie CD54 e CD90 MSC ordinando cellula magnetica. Espressione di marcatori di superficie CD54 e CD90 sono stati poi confermati da analisi di citometria a flusso. HSC marcatore CD45 è stato incluso anche per verificare se l'ordine MSCs erano impoverito di cellule staminali. MSC sono naturalmente molto eterogenei. Ci sono sottopopolazioni di cellule che hanno forme diverse, la proliferazione e le capacità di differenziazione. Queste sottopopolazioni tutti esprimono il marker noto MSC e nessun indicatore unico è stato ancora identificato per le diverse sottopopolazioni. Pertanto, un approccio alternativo per separare le diverse sottopopolazioni utilizza bombole di clonazione per separare le singole cellule derivate colonia. Le cellule derivate dal singolo colonie possono essere colti e valutati separatamente.
Protocol
1. Isolamento di cellule staminali mesenchimali di ratto
Cellule staminali mesenchimali sono state isolate da 6-8 settimane vecchio Sprague-Dawley ratto femmina come descritto in precedenza 1, 2. Isolato MSC possono aderire alla superficie di plastica e facilmente espandersi durante coltura in vitro.
- L'animale è stato messo in una camera di anestesia e anestetizzati per circa cinque minuti. Durante l'anestesia, osservare la velocità di lampeggio, la respirazione e l'attività motoria. Rimuovere l'animale dalla camera subito dopo si ferma l'attività motoria e il tasso di lampeggiante diventa infrequenti.
- Stendere l'animale verso il basso su una stazione di funzionamento e uccidere l'animale da dislocazione cervicale. Tagliare i femori e tibie dagli arti indietro, togliere la pelle ed i muscoli.
- Mettere il femori e tibie sezionato in 70% di isopropanolo per alcuni secondi e trasferimento 1X D-PBS.
- In un armadio biosicurezza, la femori e tibie sono stati trasferiti in un piatto contenente DMEM 10 centimetri. Ogni osso è stato poi tenuto con le pinzette e le due estremità sono state tagliate aperto con una forbice. Inserire un ago 22G di una siringa da 3 ml e riempirlo con DMEM, poi a filo il midollo in una provetta da 50 ml inserendo l'ago di una estremità aperta del tessuto osseo. Ripetere 2 ~ 3 volte per ogni osso. Quando tutte le zucchine sono stati ottenuti, risospendere le cellule e passare la sospensione cellulare attraverso un colino cellula 70μm per rimuovere i detriti delle ossa e degli aggregati del sangue.
- Spin le cellule a 200g, 4 ° C per 5 minuti e rimuovere il surnatante tramite aspirazione. Risospendere le cellule in media 25ml MSC (DMEM contenente 10% FBS e 1% Pen-Strep). Sospensione cellulare 10ml è stato seminato in ciascuna delle piastre cultura 10cm per un totale di due piatti. Tenere i piatti della cultura a 37 ° C e 5% CO 2 incubatore per 1 ~ 2 settimane. Medio è stato cambiato ogni 2 ~ 3 giorni.
2. Arricchimento di MSC Rat
Un certo numero di proteine di superficie sono stati utilizzati per arricchire MSC, tra CD54, CD90, CD73, CD105 e CD271 3-5. Nel nostro studio, abbiamo utilizzato CD54 e CD90 come marcatori per arricchire MSC ordinando cellula magnetica.
- Quando le cellule ha raggiunto circa l'80% confluenza, aspirare il terreno e aggiungere 4 ~ 5 ml di tripsina-EDTA per ogni piatto. Mettere i piatti nuovo al incubatore e incubare per circa 5 minuti per consentire il distacco delle cellule. Una volta che le cellule erano staccati, aggiungere pari quantità di terreno di coltura per inattivare la tripsina. Raccogliere sospensione cellulare in un tubo 15ml e cellule spin down a 200g, 4 ° C per 5 minuti.
- I passi successivi descrivono come arricchire MSC da due marcatori di superficie CD54 e CD90 secondo il manuale per la separazione delle cellule utilizzando BD IMagnet. Pellet cellulare è stato risospeso in tampone di colorazione della cellula (3% di calore FBS inattivato in 1X D-PBS) a 20 milioni di cellule / ml. Biotinilato anticorpi CD54 (0.25μg per milione di cellule) e biotinilato anticorpi CD90 (0.15μg per milione di cellule) è stato aggiunto e mescolato delicatamente con la sospensione cellulare. Dopo incubazione in ghiaccio per 15 minuti, cellule marcate sono state lavate con un volume in eccesso di tampone 1X BD Imag. Le cellule sono state etichettate centrifugare a 200g, 4 ° C per 5 minuti.
- Vortex il BD Imag particelle streptavidina fondo si aggiunge particelle 40μl per ogni 10 milioni di cellule. Mescolare la particella con le cellule etichettate bene e incubare le cellule a 6 ~ 12 ° C per 30 minuti. Questo permette alle particelle streptavidina di legarsi alla biotinilato anti-CD54 e anti-CD90, che è legato alle proteine di superficie CD54 e CD90 rispettivamente.
- Durante il periodo di incubazione, etichettare un fondo rotondo provetta per raccogliere la frazione positiva. Dopo l'incubazione, portare il volume di etichettatura a 20 milioni di cellule / ml con tampone 1X BD Imag e trasferire le cellule etichettati per il positivo-frazione tubo di raccolta. Posizionare il tubo positivo frazione sul IMagnet BD e lasciate stare per 6 minuti, quindi rimuovere il surnatante con una pipetta Pasteur in vetro con tubo positivo-frazione ancora sul IMagnet BD.
- Rimuovere il positivo frazione tubo dalla IMagnet BD e posizionarlo sul ghiaccio. Aggiungere 1ml ghiacciata 1X BD tampone Imag e risospendere le cellule mescolando delicatamente. Posizionare il tubo di nuovo sul IMagnet BD e lasciar stare per 2 ~ 4 minuti. Eliminare il surnatante con una pipetta Pasteur nuovo vetro. Ripetere il lavaggio come descritto in 2.5 ancora una volta.
- Togliere la provetta dal IMagnet BD e risospendere le cellule nel terreno di coltura, proprio seme 75 centimetri 2 fiasco per il mantenimento delle cellule e un piatto 10cm per citometria a flusso.
3. Verifica della espressione di superficie Marker mediante citometria di flusso
Analisi di citometria a flusso è stata effettuata per verificare le cellule abbiamo ottenuto esprimere CD54 e CD90. L'HSC marcatore CD45 è stato utilizzato per confermare che il MSC erano impoverito di cellule staminali.
- Quando le cellule divengono confluenti ~ 80%, trypsinize cellule con tripsina-EDTA e raccogliere le cellule in una provetta da 15 ml. Centrifugare a 200g, 4 ° C per 5 minuti per raccogliere le cellule.
- Aspirare il surnatante e sicellule h con 1X D-PBS una volta. Risospendere le cellule in tampone di colorazione della cellula (1X D-PBS contenente 2% di FBS e sodio azide 0,05%) ad una concentrazione finale di 5 ~ 10 milioni di cellule / ml e mantenere le cellule in ghiaccio. Aliquota 100μl sospensione cellulare in sei provette etichettate (1 solo le celle; 2. Isotipo di controllo IgG2a;.. 3 Controllo Isotipo IgG1, 4 CD45; 5. CD54;.. 6 CD90).
- Aggiungere i controlli isotipo e gli anticorpi primari a concentrazioni appropriate (IgG2a e IgG1: 20μl per milione di cellule; CD45: 0.5μg per milione di cellule; CD54: 0.25μg per milione di cellule; CD90: 0.15μg per milione di cellule) e incubare a 4 ° C per 30 minuti.
- Lavare le cellule con PBS 1X D-due volte e poi risospendere le cellule nel buffer 100μl colorazione delle cellule. Aggiungi SA-PE (streptavidina-ficoeritrina, utilizzare 0.15μg per milione di cellule) e incubare a 4 ° C per 30 minuti al buio.
- Lavare le cellule marcate con 1X D-PBS due volte. Risospendere le cellule in tampone 400μl colorazione delle cellule e trasferimento in un tubo falcon per l'analisi di citometria a flusso.
4. Separazione di singola colonia di cellule staminali mesenchimali derivate
MSC è una popolazione eterogenea composta da diverse sottopopolazioni di cellule di forma diversa, il tasso di crescita così come la capacità di differenziazione 6. Tuttavia, tutte le sottopopolazioni esprimere i marcatori MSC conosciuto e quindi non è possibile utilizzare marcatori per separare queste sottopopolazioni. Pertanto, abbiamo applicato cilindri clonazione di separare le diverse sottopopolazioni, che sono colonie formate da singole cellule.
- Cellule piastra a circa 50 ~ 100 cellule per piatto 10 cm. Incubare a 37 ° C e 5% CO 2 incubatore per 1 ~ 2 settimane. Durante questo periodo, esaminare colonie ben isolate con un microscopio invertito. Una volta che le colonie hanno raggiunto dimensioni abbastanza grandi (meglio più di 100 cellule in ogni colonia), segnare le colonie con un pennarello sul fondo del piatto. Quando prelevare la colonia da marcare, assicurarsi che non ci sono colonie circostanti nei pressi del raccolto uno.
- Aspirare il terreno e lavare il piatto una volta con D-PBS 1X. Prendete un cilindro sterile clonazione con una pinza sterile e delicatamente luogo intorno alla colonia segnato. Ripetere questa operazione fino a quando tutte le colonie ha segnato un cilindro posto sopra la clonazione. Le colonie raccolte dovrebbero essere distanti tra loro come gli altri che ogni cilindro clonazione contiene solo una colonia.
- Aggiungere 100μl tripsina-EDTA per ogni cilindro la clonazione e mettere il piatto indietro l'incubatore per ~ 5 minuti. Dopo 5 minuti, controllare le cellule al microscopio per vedere se sono arrotondamenti. Quando le cellule hanno innalzato, aggiungere pari quantità di terreno di coltura per inattivare la tripsina. Mescolare la sospensione cellulare con una micropipettor 200μl e trasferire la sospensione cellulare per un piatto 60 millimetri contenente 3 ml di media cultura preriscaldata. Etichetta i piatti correttamente e rimetterli in incubatrice. Rilevamento delle modifiche morfologiche nei prossimi giorni.
5. Rappresentante Risultati
Secondo il protocollo descritto nella parte per l'isolamento ratto MSC, MSC plastica aderente deve essere visibile il giorno dopo placcatura. Mentre le cellule continuano a proliferare, le cellule confluenti dovrebbe apparire come le cellule mostrato nella Figura 1A. Quando le cellule raggiungono confluenza ~ 80% (Figura 1B), trapianto può essere eseguita. Durante la sottocultura, tripsina-EDTA è stato utilizzato per staccare le cellule e le cellule sollevato sono piccoli e rotondi come mostrato nella Figura 1C.
Figura 1. Contrasto delle immagini fase di MSC ratto. (A) confluenti MSC. La maggior parte delle cellule sono simili a mandrino o stella-like. (B) MSC circa l'80% confluenza. (C), le cellule revocato dopo tripsinizzazione sono piccoli e rotondi.
Una volta che cellule staminali mesenchimali sono arricchite da cell sorting magnetico, citometria a flusso analisi viene effettuata per verificare le espressioni superficie marcatore. Se l'arricchimento è buono, le cellule dovrebbero mostrare colorazione positiva contro la MSC marcatori CD54 e CD90 ma negativo contro il marker CD45 HSC (Figura 2). Isotipo IgG1 controlli IgG2a e sono utilizzati come controlli negativi.
Figura 2. Analisi di citometria a flusso delle cellule staminali mesenchimali per i marcatori di superficie. Cellule staminali mesenchimali sono stati etichettati con anticorpi contro IgG2a (isotipo di controllo 1), IgG1 (isotipo di controllo 2), CD45, CD54 e CD90. MSC espresso CD54 e CD90 ma non CD45.
Quando le cellule sono seminate a propria densità clonale, colonie dovrebbe passare da singole cellule. Figura 3A rappresenta una colonia formata da una sola cellula. Cilindri di clonazione può quindi essere utilizzata per separare le colonie e le cellule derivate dalle colonie possono essere coltivate separatamente. Figura 3B e 3C rappresenta cellule derivate da due singole colonie. Le cellule derivate da colonia 1 sono come mandrino (Figura 3B), mentre le cellule derivate da colonia 2 sono rotondi (Figura 3C).
Figura 3. Formazione di colonie di cellule staminali mesenchimali e single-colonia di cellule derivate. MSCs colto in colonie clonale densità forma individuale. Queste colonie possono essere separate da cilindri di clonazione e cellule provenienti da colonie diverse possono essere coltivate separatamente. (A) Una colonia rappresentativo formato da MSC quando placcato a densità clonale. (B) Mandrino-come le cellule derivate da una colonia. (C) cellule rotonde derivata da un'altra colonia.
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Discussion
Questo protocollo descrive come isolare ed arricchire MSC. Un metodo per separare la singola colonia di cellule derivate anche incorporato. Ci sono diversi passaggi che sono importanti per una separazione efficace isolamento, l'arricchimento e la colonia. Mentre fate isolamento delle cellule di ratto, si consiglia di filtrare attraverso un colino cellulare o una maglia di nylon sterili di dimensioni simili a sbarazzarsi dei coaguli di sangue e frammenti ossei. Dopo placcatura le cellule durante la notte, molte cellule morte saranno galleggiante nel mezzo e le cellule morte vengono rimosse sostituendo con mezzo fresco, che dovrebbe aiutare la crescita delle cellule allegato.
La cella magnetica ordinamento in questo protocollo descrive come eseguire una selezione positiva, e le procedure simili possono essere utilizzati per eseguire una selezione negativa. La quantità di anticorpi da aggiungere può variare e ottimizzazione è necessario per ottenere una migliore selezione. Questo vale anche per l'etichettatura delle cellule per l'analisi di citometria a flusso. Se non si ha l'analisi di citometria a flusso per i campioni etichettati immediatamente, i campioni possono essere fissati con formaldeide al 2% e fino a tardi. Tuttavia, deposito a lungo termine non è raccomandato in quanto questo tende ad aumentare l'auto-fluorescenza e campione di qualità sacrificio.
La parte fondamentale per la separazione colonia è la semina a densità cellulare destra (che dovrebbe essere ottimizzato sperimentalmente) e localizzare singoli cloni che non sono circondati da altri cloni. Se ci sono altri cloni nelle vicinanze, il cilindro di clonazione possono comprendere i cloni nelle vicinanze e le cellule ottenute non sarà più di un clone. Quando si posiziona il cilindro over clonazione clone, anche fare attenzione a non farla scorrere sulla superficie del piatto come questo farà sì che il grasso al silicone sul fondo del cilindro clonazione per coprire le cellule ed impedire la tripsina di raggiungere le cellule a staccarli.
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Acknowledgments
Il lavoro è stato sostenuto in parte dal National Institute of Health (R01GM079688, R21RR024439 e R21GM075838), National Science Foundation (cbet 0.941.055), e la Fondazione MSU.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X D-PBS | Invitrogen | 14040-133 | |
| DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| FBS | Invitrogen | 26140-079 | |
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| BD Imagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| Biotin mouse IgG2a | BD Biosciences | 555572 | |
| Biotin mouse IgG1 | BD Biosciences | 555747 | |
| Biotin anti-rat CD54 | Cedarlane Labs | CL054B | |
| Biotin anti-rat CD90 | Cedarlane Labs | CL005B | |
| Biotin anti-rat CD45 | Cedarlane Labs | CL001B | |
| BD Imag buffer | BD Biosciences | 552362 | |
| Round-bottom tube | BD Biosciences | 352063 | |
| Streptavidin particles | BD Biosciences | 557812 | |
| SA-PE | R&D Systems | F0040 | |
| Cloning cylinder | Sigma-Aldrich | C2059 |
References
- de Hemptinne, I., Vermeiren, C., Maloteaux, J. M., Hermans, E. Induction of glial glutamate transporters in adult mesenchymal stem cells. J Neurochem. 91, 155-166 (2004).
- Porter, R. M., Huckle, W. R., Goldstein, A. S. Effect of dexamethasone withdrawal on osteoblastic differentiation of bone marrow stromal cells. J Cell Biochem. 90, 13-22 (2003).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25, 2739-2749 (2007).
- Abdallah, B. M., Kassem, M. Human mesenchymal stem cells: from basic biology to clinical applications. Gene Ther. 15, 109-116 (2008).
- Erica, L., Herzog, L. C., Diane, S. Krause Plasticity of marrow-derived stem cells. Blood. 102, 3483-3493 (2003).
- Colter, D. C., Sekiya, I., Prockop, D. J. Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 7841-7845 (2001).
