Enlèvement du puparium d’insectes : une méthode d’investigation pupal

Overview

Cet article décrit une technique pour enlever le puparium d’un insecte tout en gardant la pupe intérieure intacte et donc apte à une enquête plus approfondie. Le protocole d’exemple montre la procédure avec Drosophila guttifera; toutefois, cette technique s’applique à d’autres espèces de Drosophiles.

Protocol

Ce protocole est un extrait de Fukutomi et coll., Methods for Staging Pupal Periods and Measurement of Wing Pigmentation of Drosophila guttifera, J. Vis. Exp. (2018).

1. Enlever le puparium

NOTE (EN) Les pupes de Drosophile sont recouvertes d’une structure appelée puparium. Un insecte de Muscomorpha (mouches) ne perd pas sa cuticule larvaire à la pupaison; au lieu de cela, il durcit la cuticule après l’apolyse, et l’utilise comme un couvercle protecteur de la pupe, le puparium. Une pupe résidant à l’intérieur d’un puparium a une véritable cuticule pupale, qui est très douce et fragile. Avant que l’apolyse n’a lieu autour de P4(ii), l’épithélie et le puparium sont attachés ensemble, et donc enlever le puparium sans dommages est très difficile. Après P5, enlever le puparium est laborieux, mais utile pour l’observation morphologique et la définition des stades pupals. Le processus est effectué comme suit.

1. Apposer un morceau de ruban adhésif à double face sur un morceau de papier essuie-tout.
2. Placez une pupe sur le côté ventral de bande à double face vers le haut( Figure 1A).
3. Localiser l’espace entre le côté antérieur du puparium et la pupe interne. Saisir et enlever le puparium autour de cet espace à l’aide de forceps, et exposer le côté antérieur de la tête de la pupe.
4. Insérez la pointe d’un forceps en le déplaçant parallèlement à l’axe antérieur-postérieur. Soulevez la pointe des forceps pour briser localement le puparium. Répétez cette action jusqu’à ce que la rupture atteigne la partie postérieure du puparium. Assurez-vous qu’un espace est également formé entre les pattes puparium et pupal, et briser le côté ventral du puparium et minimiser les dommages à la pupe interne (Figure 1B).
5. Après avoir cassé le puparium autant que possible, sortez la pupe à l’aide d’un pinceau fin (#5/0) (Figure 1C).
6. Placer la pupe sur un morceau de papier de soie humidifié avec ddH₂O et placé dans une boîte en plastique Petri (diamètre 60 mm x hauteur 15 mm). Prenez des photos dès que possible parce que la pupe exposée est vulnérable et devient facilement sèche.
    

Representative Results

Figure 1. Illustration de l’enlèvement du puparium. (A) Placez un côté ventral de pupe vers le haut sur un morceau de ruban adhésif à double face. Retirer la partie antérieure du puparium. (B) Casser le puparium avec des forceps du côté ventral. (C) Après avoir cassé le puparium, sortez la pupe à l’aide d’un pinceau.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila guttifera	The Drosophila Species Stock Center at the U.C. San Diego	15130-1971.10	Drosophila guttifera,  a fruit fly species used in this article
NICETACK double sided tape	Nichiban	NW-15SF	Double sided tape,   for removing puparium
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-20	Forceps,  for removing puparium
Van Gogh VISUAL Paint brush	Talens Japan	GWVR-#5/0	Paint brush,  for removing puparium
Stereomicroscope	Olympus	SZX16	Stereomicroscope,  for morphological observation
Digital camera	Olympus	DSE-330-A	Digital camera,  for imaging
Falcon standard tissue culture dish	Corning	353002	Plastic Petri dish (diameter 60 mm x height 15 mm)