Insekten-Puparium-Entfernung: Eine Methode für Pupal-Untersuchung

Overview

Dieser Artikel beschreibt eine Technik, um das Puparium eines Insekts zu entfernen, während die innere Pupa intakt bleibt und daher für weitere Untersuchungen geeignet ist. Das Beispielprotokoll zeigt das Verfahren mit Drosophila guttifera; diese Technik ist jedoch auf andere Drosophila-Arten anwendbar.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Fukutomi et al., Methods for Staging Pupal Periods and Measurement of Wing Pigmentation of Drosophila guttifera, J. Vis. Exp. (2018).

1. Entfernen von Puparium

ANMERKUNG Pupae von Drosophila sind von einer Struktur namens Puparium bedeckt. Ein Insekt von Muscomorpha (Fliegen) vergießt seine Larvenhaut nicht bei der Verpuppe; stattdessen härtet es die Nagelhaut nach der Apolyse aus und verwendet sie als Schutzhülle des Pupa, des Pupariums. Eine Pupa, die in einem Puparium wohnt, hat eine echte Pupal-Kine, die sehr weich und zerbrechlich ist. Bevor um P4(ii) eine Apolyse stattfindet, werden Epithelie und Puparium miteinander verbunden, so dass es sehr schwierig ist, das Puparium ohne Beschädigung zu entfernen. Nach P5 ist das Entfernen des Pupariums mühsam, aber nützlich für die morphologische Beobachtung und Definition von Pupalstadien. Der Prozess wird wie folgt durchgeführt.

1. Befestigen Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband auf einem Papiertuch.
2. Legen Sie eine Pupa auf die doppelseitige Band-Ventralseite nach oben (Abbildung 1A).
3. Suchen Sie den Raum zwischen der vorderen Seite des Pupariums und der internen Pupa. Greifen und entfernen Sie das Puparium um diese Lücke mit Zangen, und belichten Sie die vordere Seite des Kopfes der Pupa.
4. Setzen Sie die Spitze einer Zange ein, indem Sie sie parallel zur vorderen hinteren Achse bewegen. Heben Sie die Spitze der Zange an, um das Puparium lokal zu brechen. Wiederholen Sie diese Aktion, bis der Bruch den hinteren Teil des Pupariums erreicht. Stellen Sie sicher, dass auch ein Spalt zwischen dem Puparium und den Pupalbeinen gebildet wird, und brechen Sie die ventrale Seite des Pupariums und minimieren Sie die Schäden an der inneren Pupilbe (Abbildung 1B).
5. Nachdem Sie das Puparium so weit wie möglich gebrochen haben, nehmen Sie die Pupa mit einem feinen Pinsel (#5/0) heraus (Abbildung 1C).
6. Legen Sie die Pupa auf ein Stück Tissuepapier, das mit ddH₂O befeuchtet und in eine Kunststoff-Petrischale (Durchmesser 60 mm x Höhe 15 mm) gelegt wurde. Fotografieren Sie so schnell wie möglich, da die exponierte Pupa anfällig ist und leicht trocken wird.
    

Representative Results

Abbildung 1. Abbildung des Entfernens von Puparium. (A) Legen Sie eine Pupa-Ventralseite auf ein Stück doppelseitiges Klebeband. Entfernen Sie den vorderen Teil des Pupariums. (B) Brechen Sie das Puparium mit Zangen von der ventralen Seite. (C) Nach dem Brechen des Pupariums die Pupa mit einem Pinsel herausnehmen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila guttifera	The Drosophila Species Stock Center at the U.C. San Diego	15130-1971.10	Drosophila guttifera,  a fruit fly species used in this article
NICETACK double sided tape	Nichiban	NW-15SF	Double sided tape,   for removing puparium
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-20	Forceps,  for removing puparium
Van Gogh VISUAL Paint brush	Talens Japan	GWVR-#5/0	Paint brush,  for removing puparium
Stereomicroscope	Olympus	SZX16	Stereomicroscope,  for morphological observation
Digital camera	Olympus	DSE-330-A	Digital camera,  for imaging
Falcon standard tissue culture dish	Corning	353002	Plastic Petri dish (diameter 60 mm x height 15 mm)