Drosophila Burrowing and Tunneling Assay: A Method to Assess Tissue Hypoxia in Fly Larvae

Overview

Dieses Video zeigt eine Methode, um Hypoxie bei Drosophila-Larven zu testen, indem sie ihre Bohr- und Tunnelfähigkeiten bewertet. Mit dieser Technik können Forscher Larven mit Sauerstoffmangel von solchen mit Entwicklungsdefiziten unterscheiden. Das Beispielprotokoll veranschaulicht die Einrichtung für diesen Test.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Qiang et al.,A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae, J. Vis. Exp. (2018).

1. Herstellung von Larven

1. Zwei oder mehr Tage vor Beginn des Testes kreuzen Sie die gewünschten Versuchs- und Kontrollkombinationen (mindestens 20 Weibchen und 10 Männchen) in Eierschalen, wie von Wieschaus und Nusslein-Volhard beschrieben, aber mit 50 ml Polypropylenbechern und 6,0 cm Einweg-Petrischalen, die Traubenagar enthalten und kurz vor dem Gebrauch mit Hefepaste verschmiert werden. Fliegen in Eierschalen bei Raumtemperatur in der Dunkelheit halten, bis sie benötigt werden.
2. Trauben-Agar-Rezept – kombinieren Sie 100 ml gefrorenes 100% Traubensaftkonzentrat, 350 ml deioinisiertes Wasser, 5 ml Eisessig und 13 g D. Melanogaster Agar in einem 1L Glasbecher. Mikrowelle in 1-2 min platzt, rühren zwischen Bursts, bis Agar ist alle aufgelöst. Kühlen Sie die Lösung für ein paar Minuten und fügen Sie dann 10 ml 10% (w/v) Nipagen (Methyl-p-Hydroxybenzoat) in 95% Ethanol hinzu. Mischen, dann Pipette 7 ml pro Platte in Einweg 6,0 cm Petrischalen, lassen Sie gelieren und trocknen bei Raumtemperatur für 3-4 h. Bei 4 °C in Plastiktüten aufbewahren.
3. Hefepaste Rezept – 7 g getrocknete Hefe, 10 ml deionisiertes Wasser, mit einem Spachtel bis zu einer gleichmäßigen Konsistenz mischen.
4. Zeitgesteuerte Eisammlungen zur Erzeugung von experimentellen und kontrollierbaren Larven. Mit neuen, hefeverschmierten Traubentellern, sammeln Eier bei Raumtemperatur für 4 h in der Dunkelheit in den Morgenstunden. Entfernen Sie diese 4 h-Sammelplatten und ersetzen Sie sie durch frische Platten. Die 4 h Sammelplatten über Nacht bei 25 °C bis zum Nachmittag des nächsten Tages bebrüten, wenn die meisten Larven geschlüpft sind. Sammeln Sie diese ersten Instar Larven und verwenden Sie sie, um das Experiment einzurichten.

2. Einrichten von Assay-Platten

1. Vorbereitung von Assayplatten. Für einen einzigen Lauf des Assays fünf Assayplatten mit je 10 experimentellen Larven und fünf Platten mit 10 Kontrolllarven vorbereiten. Verwenden Sie einen 1,5 cm Korkbohrer, um einen zentralen Agarkern von jedem Teller zu entfernen und so ein Loch für das Futter zu schaffen. Hefepaste (0,8 - 0,9 g) in das Loch geben und sanft mit einem Spachtel klopfen, um einen Hügel zu machen, der das Loch füllt.
2. Agarplattenzubereitung – 700 ml entionisiertes Wasser mit 16 g D. melanogaster Agar in einem 2L Glasbecher und Mikrowelle für 5 min kombinieren. Von der Mikrowelle nehmen und mit einer Glasstange umrühren, um ungelösten Agar in die Lösung zu bringen. 17,5 ml 10% (w/v) Nipagen in 95% Ethanol hinzufügen, mischen, dann die Mikrowellenerwärmung in 30 s Bursts fortsetzen, gefolgt vom Rühren, bis sich alle Agar vollständig aufgelöst haben. Abkühlen für ein oder zwei Minuten, dann Pipette 15 ml Aliquots in 10 cm Kunststoff Petrischalen. Agar gelieren lassen, Teller mit Deckeln bedecken und bei Raumtemperatur für ein paar Stunden oder über Nacht trocknen lassen. Platten in versiegelten Plastiktüten bei 18 °C lagern.
   ANMERKUNG 1: Um die Bildung von Nipagen-Kristallen auf der Oberfläche der Platten aufgrund übermäßiger Trocknung zu vermeiden, verwenden Sie Platten innerhalb weniger Tage nach der Vorbereitung. Bei Bedarf können Kristalle wieder aufgelöst werden, indem man ein paar Mikroliter 95% Alkohol auf sie abgibt.
   ANMERKUNG 2: Agar-Chargen können unterschiedliche Geliereigenschaften haben. Die trockenen Gelplatten sollten fest an der Berührung und ausreichend belastbar sein, dass ein sauberer, intakter Agarkreis entfernt werden kann, wenn der Korkbohrer verwendet wird, um das Nahrungsloch zu schaffen (siehe oben).
3. Larven in Assayplatten einrichten. Verwenden Sie mechanischen Druck, um die Spitze eines Kunststoff-Mikrospatula zu kurven und tauchen Sie die Spitze in Hefepaste, um "Klebstoff" für die Aufnahme von Larven zur Verfügung zu stellen. Nehmen Sie die ersten Instar-Larven einzeln auf und legen Sie sie auf den Agarteller in der Nähe des Futterhügels. Bereiten Sie mindestens fünf Replikationsplatten mit 10 Larven für experimentelle und Kontrollgenotypen vor. Nach Fertigstellung jede Platte verdecken und beschriften und die Platten (Deckelseite nach oben) in einem dunklen Raum bei Raumtemperatur (in unserem Labor sind es 22 °C).

3. Überwachung von Assay-Platten

1. Untersuchen Sie täglich Platten unter einem Sezieren des Mikroskops und erfassen Sie die Anzahl der Larven auf der Oberseite des Futters oder auf der Agaroberfläche. Beachten Sie alle sichtbaren toten oder sterbenden Larven. Beachten Sie, wann und ob das Tunneln in das Agar-Substrat umgesehen wird, da Larven sich in den dritten Instern bewegen. Beachten Sie Daten, an denen Pupae beginnen, sich zu bilden und notieren Sie alle pupal Anomalien. Fahren Sie mit den täglichen Beobachtungen fort, bis alle Larven gestorben oder verpupiert sind.
2. Entfernen Sie Die Welpen vorsichtig vom Teller mit einer gebogenen Neckungsnadel und auf einen Traubenteller übertragen. Wenn gewünscht, fahren Sie mit der Überwachung von Pupas fort, um zu bestimmen, wie viele als Erwachsene schließen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Dehydrated yeast
Frozen grape juice concentrate	Welch's		Available at most large supermarkets
Glacial acetic acid	Sigma-Aldrich	320099
Drosophila agar	Apex Bioresearch Products	66-103
Methyl-para-hydroxybenzoate	Apex Bioresearch Products	20-658
EQUIPMENT
50 ml polypropylene beakers
6.0 cm disposable Petri dishes	Falcon	08757100B
10 cm disposable plastic Petri dishes	E+K Scientific	EK-24104
Plastic microspatulas	Corning Incorporated	3012
Bent teasing needle	Nasco	S08848MH
Dissecting microscope			Any microscope with 10-30X magnification