Zebrafisch-Elektrokardiographie (EKG): Ein minimalinvasiver Assay zur Beurteilung der Herzfunktion

Overview

Dieses Video zeigt, wie Elektrokardiographie (EKG oder EKG) Messungen, ein Test, der die elektrische Aktivität des Herzens misst, an einem Zebrafisch durchführt.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Zhao et al, In Vivo Surface Electrocardiography for Adult Zebrafish, J. Vis. Exp. (2019).

Alle Experimente in dieser Studie wurden in Übereinstimmung mit dem US National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt. Alle Tierprotokolle in dieser Studie wurden vom UCLA Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt.

1. Anästhesie-Induktion

1. Bereiten Sie die Tauchanästhesie zur Schmerzkontrolle und Zurmobilisierung von Fischen vor, um Bewegungsartefakte während der EKG-Datenerfassung zu vermeiden. Die meisten Laboratorien verwenden Tauchtrikuain (Ethyl 3-Aminobenzoat-Methansulfonat, MS-222).
   1. Um die Tricain 0,4% Stofflösung zu machen, kombinieren Sie die folgenden Elemente in einer verschraubten dunklen Glasflasche: 400 mg Tricainpulver, 98 ml doppelt destilliertes Wasser und 2 ml 1 M Tris (pH 9). Stellen Sie nach Bedarf pH 7.0 mit 1 N NaOH oder 1 N HCl ein.
   2. Um die Tricain-End-Immersion-Lösung zu machen, bestimmen Sie die Minimale Konzentration, die für das Zebrafischalter, die Größe, den Stoffwechselzustand, den Stamm, das Krankheitsmodell, die wissenschaftlichen Ziele und die Verfahrensdauer geeignet ist.
   3. Führen Sie eine Tricain-Konzentrations-Reaktionsstudie durch, die von der empfohlenen Konzentration von 168 mg/L (oder 0,0168%)⁹bei Bedarf nach oben oder unten titiert wird, um die Stufe 4 der Anästhesie innerhalb von 3 min mit den wenigsten kardioratorischen Toxizitäten zu erreichen. In dieser Studie wird beispielsweise das Eintauchen von Wild-AB-Zebrafischen im Alter von 12-18 Monaten in eine 0,02-0,04% Tricainlösung innerhalb von 3 min an Anästhesiestufe 4 induzieren.
      HINWEIS: Bei Stufe 4 der Anästhesie gehen Gleichgewicht und Muskeltonus vollständig verloren und die Bewegungsgeschwindigkeit wird reduziert.
   4. Falls erforderlich, wenden Sie sich an den Tierarzt im Institutionellen Ausschuss für Tierpflege und -verwendung (IACUC), um zusätzliche Hinweise zur Angemessenheit der Auswahl des/der Anästhetika und des Verabreichungswegs zu erhalten.
2. Tauchen Sie einen erwachsenen Zebrafisch in eine Schüssel ein, die Tricainlösung der niedrigsten vorbestimmten und IACUC-zugelassenen Konzentration (z. B. 0,02-0,04 % in dieser Studie) enthält, um die Anästhesiestufe 4 innerhalb von 3 min zu induzieren(Abbildung 1).
   1. Für das Überlebens-EKG-Protokoll, halten Sie die EKG-Aufnahmesitzung so kurz wie möglich (unter 10 min). Für kurze EKG-Aufnahmesitzungen von weniger als 15 min ist keine Anästhesiewartung erforderlich.
   2. Verwenden Sie für lange EKG-Aufnahmesitzungen, die Stunden dauern, einen lang wirkenden intramuskulären Paralytikum und ein orales Perfusionssystem, um ausreichend Feuchtigkeit und Sauerstoffzufuhr zu gewährleisten.

2. EKG-Leitungsplatzierung

1. Sobald der Zebrafisch die Stufe 4 der Anästhesie für 3 s aufrechterhält, verwenden Sie ein Paar stumpfe Zangen, um den Fisch sofort auf den feuchten Schwammschlitz mit seiner ventralen Oberfläche zu übertragen, der für die Platzierung von EKG-Bleielektroden an erster Stelle steht (Abbildung 2).
2. Setzen Sie die drei EKG-Bleielektroden vorsichtig in die Fischmuskulatur bis etwa 1 mm Tiefe ein, um eine bipolare Leitung in der Frontalebene zu etablieren, die mit der linken kaudalen-rechten Schädelausrichtung der Herzhauptachse verläuft.
3. Positionieren Sie die positive (rote) Elektrode in der ventralen Mittellinie auf der Ebene des bulbus arteriosus, d.h. bei 1-2 mm über einer imaginären Linie, die die beiden unteren Kanten der Operculums verbindet (Abbildung 2A).
4. Positionieren Sie die negative (schwarze) Elektrode kauarisch und 0,5-1,0 mm seitlich links zur positiven Elektrode, in einem Abstand größer als die maximale apicobasale Länge des erwachsenen Zebrafischventrikels (Abbildung 2A).
5. Positionieren Sie die Referenzelektrode caudally in der Nähe des Analbereichs.
   HINWEIS: Da die Herz-Hauptachse etwas von Fisch zu Fisch variiert, um die R- und T-Wellenamplituden zu maximieren, passen Sie die Bleipositionen an, indem Sie nur kleine, systematische Änderungen durch Versuch und Irrtum vornehmen. Ändern Sie z. B. eine Elektrode (positiv oder negativ) anstelle beider Elektroden gleichzeitig und nehmen Sie schrittweise Änderungen in einer bestimmten Richtung vor, bevor Sie in eine andere Richtung wechseln, anstatt unregelmäßige Änderungen in zufälligen Richtungen vorzunehmen.

3. EKG-Aufzeichnung

1. Öffnen Sie das EKG-Datenerfassungsprogramm. Wählen Sie eine gewünschte Einstellung aus den Dropdown-Menüs für Reichweite, Tiefpass und Hochpass aus. Beispielsweise ergibt die folgende Einstellung im in vivo EKG-Aufzeichnungssystem, das in diesem Experiment verwendet wird, ein konsistentes, zufriedenstellendes Signal-Rausch-Verhältnis für einen normalen erwachsenen Zebrafisch: Bereich "2 mV", Tiefpass "120 Hz" und Hochpass "0,03 s".
2. Drücken Sie Start, um eine kontinuierliche lückenlose EKG-Aufnahme mit einer Abtastrate von 1 kHz zu starten.
3. Um die Bleipositionierung für ein maximales Signal-Rausch-Verhältnis zu optimieren, drücken Sie Stop, um die EKG-Aufnahme zu stoppen und die EKG-Spur kurz nach dem allerersten Aufnahmeversuch für jedes Herz zu überprüfen. Um zu diagnostizieren, dass ein erwachsenes Zebrafisch-EKG normal ist, bestätigen Sie, dass alle folgenden vier Validierungskriterien erfüllt sind (Abbildung 3):
   1. Kriterium 1: Stellen Sie sicher, dass alle EKG-Wellenformen (P, QRS und T) unterschiedlich und gut sichtbar sind.
   2. Kriterium 2: Stellen Sie sicher, dass die P-Welle positiv ist.
   3. Kriterium 3: Stellen Sie sicher, dass der Netto-QRS-Komplex positiv ist (d. h. die R-Wellenamplitude ist größer als die Summe der Q- und S-Wellenamplituden).
   4. Kriterium 4: Stellen Sie sicher, dass die T-Welle positiv ist.
4. Wenn ein normales EKG erwartet wird, positionieren Sie die Elektroden (versuchen Sie die negative Elektrode zuerst), bis alle vier Validierungskriterien erfüllt sind.
5. Wenn eine normale T-Welle erwartet wird, aber die T-Welle zu klein ist, positionieren Sie die Elektroden neu, um die Amplitude der T-Welle zu maximieren.
6. Fortsetzen der EKG-Aufnahme nach Deroptimierung der Lead-Positionierung. Speichern Sie die EKG-Sweeps für die nachfolgende Analyse.

4. Erholung aus der Anästhesie

1. Entfernen Sie am Ende der EKG-Aufnahmesitzung die Elektroden vorsichtig, ohne den Fisch zu verletzen. Den Fisch in frisches, sauerstoffreiches Fischwasser frei von Tricain geben.
2. Um die Erholung von der Anästhesie zu erleichtern, spritzen Sie wasser über die Kiemen kräftig mit einer Pasteur Pipette, bis der Fisch die regelmäßige Kiemenbewegung oder das Schwimmen wieder aufnimmt.
3. Überwachen Sie die Fische auf vollständige Erholung von der Anästhesie (in der Regel 1-2 min), wie durch die Fähigkeit der Fische angezeigt, aufrecht für mindestens 5 s zu schwimmen.

Representative Results

Abbildung 1: Minimalinvasives In-vivo-EKG-Aufzeichnungsprotokoll. Ein schematisches Flussdiagramm veranschaulicht vier kritische Aktionsschritte bei der Durchführung einer In-vivo-EKG-Abfrage: Anästhesie induzieren, EKG-Bleielektroden platzieren, EKG aufzeichnen und die EKG-Aufnahmen analysieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: EKG-Leitungsplatzierung. Drei farbcodierte Edelstahlelektroden mit 29 Spurweiten werden bis ca. 1 mm tief sicher in die Fischmuskulatur eingesetzt. Die Platzierung der negativen (schwarzen) Elektrode und der positiven (roten) Elektrode stellt eine bipolare Führungslinie in der Frontalebene entlang einer linken kaudalen nach rechten Schädelausrichtung her. Abkürzung: ref, referenz elektrode. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Kontrastanatomie und EKG von Menschen- und Zebrafischherzen. Im Gegensatz zum menschlichen Herzen mit zwei Vorhöfen und zwei Ventrikeln hat das Zebrafischherz nur ein Atrium und einen Ventrikel (obere Reihe). Abkürzungen: RA, rechtes Atrium; LA, linkes Atrium; RV, rechter Ventrikel; LV: linker Ventrikel. Das Zebrafischherz teilt mehrere gemeinsame EKG-Funktionen mit dem menschlichen Herzen (untere Reihe). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture dishes	Fisher Scientific	FB087571	100 mm x 20 mm
Dumont Forceps	Fine Sciense Tools	11253-20	0.1 x 0.06 mm
FE136 Animal Bio Amp	AD Instruments	FE231
Iris Forceps	Fine Sciense Tools	11064-07	0.6 x 0.5 mm
LabChart 8 Pro	AD Instruments		Software with ECG Module
Needle electrodes for Animal Bio Amp	AD Instruments	MLA1213	29 gauge
Plastic Disposable Transfer Pipets	Fisher Scientific	13-669-12	6 in., 1.2 mL
PowerLab 4/35	AD Instruments	4//35
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)	Sigma	E10521-10G	MS-222