Overview
عند تلطيخ أقراص Drosophila التصويرية ، غالبا ما يتم إجراء تشريح خشن حيث تتعرض الأقراص ولكنها تظل متصلة بالجسم. مرة واحدة ملطخة، يتم عزل أقراص الفائدة وشنت. يوضح بروتوكول المثال إجراء تشريح القرص التصويري للجناح وتركيبه.
Protocol
هذا البروتوكول هو مقتطف من موريموتو وتاموري ، تحريض وتشخيص الأورام في Drosophila Imaginal Disc Epithelia ، J. Vis. Exp. (2017).
1. تشريح اليرقات
- جمع تجول اليرقات نجمة الثالثة مع عصا خشبية أو ملقط حاد، النمط الجيني لهم من قبل علامات الفلورسنت المناسبة(على سبيل المثال،EGFP) تحت المجهر مجسمة مفلورة ووضعها في طبق تشريح مع برنامج تلفزيوني (الفوسفات العازلة المالحة).
- غسل اليرقات في برنامج تلفزيوني عن طريق pipetting مع 2 مل من البلاستيك نقل ماصة.
- قرصة مركز اليرقة مع ملقط واحد وتمزيق الجسم إلى نصفين مع ملقط أخرى.
- قرصة هوك الفم من النصف الأمامي مع ملقط واحد ودفع الفم نحو الجسم مع ملقط أخرى لتحويل الجسم من الداخل إلى الخارج.
- إزالة المواد غير الضرورية مثل الغدد اللعابية أو الأجسام الدهنية مع ملقط.
2. التثبيت وتلطيخ الأجسام المضادة
- نقل النصف الأمامي تشريح الجسم اليرقات (بما في ذلك أقراص الجناح التصويري) إلى أنبوب بلاستيكي 1.5 مل وإصلاح في 1 مل من حل الإصلاح (4٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني) لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام مع تناوب لطيف.
تحذير: الفورمالديهايد سام ولديه إمكانات مسرطنة. ارتداء قفازات واقية والملابس لمنع ملامسة الجلد.
ملاحظة: في هذا الجزء ، تجري جميع الخطوات على نوتاتور في درجة حرارة الغرفة في الظلام ما لم يذكر خلاف ذلك. - إزالة الحل إصلاح وتجاهل. غسل الأنسجة مع 1 مل من PBT (0.3٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني) ثلاث مرات لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
- إزالة PBT وإضافة 1 مل من PBTG (0.2٪ ألبوم مصل البقر و 5٪ مصل الماعز العادي في PBT) لمنع وجوزة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
- إزالة PBTG وإضافة حل الأجسام المضادة الأولية المخفف بشكل مناسب مع PBTG (انظر جدول المواد)وجوزات بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
- إزالة الحل الأساسي للأجسام المضادة وغسل الأنسجة مع 1 مل PBT ثلاث مرات لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
- إزالة PBT وإضافة حل الأجسام المضادة الثانوية المخفف بشكل مناسب مع PBTG (1:400). نوتات لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 °C.
- إزالة محلول الأجسام المضادة الثانوية وغسل الأنسجة مع 1 مل من PBT مرتين لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
- وصمة عار F-أكتين, إزالة PBT وإضافة محلول Phalloidin المخفف بشكل مناسب في برنامج تلفزيوني (1:40). ثم جوزة لمدة 20 دقيقة. إزالة محلول Phalloidin وغسل الأنسجة مع 1 مل من PBT مرتين لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
- لمواجهة الحمض النووي، قم بإزالة PBT وإضافة محلول DAPI (4'، 6-diamidino-2-phenylindole) (0.5 ميكروغرام/مل من DAPI في PBS). ثم جوزة 10 دقيقة.
تحذير: DAPI لديه إمكانات مسرطنة. ارتداء قفازات واقية والملابس لمنع ملامسة الجلد. - إزالة محلول DAPI وغسل الأنسجة مع 1 مل من PBT مرتين لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
- شطف مرة واحدة في 1 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 500 μL من 100 ٪ الجلسرين كوسيلة ما قبل تصاعد.
3. تصاعد على الشرائح المجهر
- وضع الأنسجة الملطخة على شريحة المجهر باستخدام ماصة نقل البلاستيك 2 مل.
- نقل الأنسجة إلى قطرات من تصاعد المتوسطة على شريحة المجهر آخر مع ملقط.
- اضغط باستمرار على نهاية الأنسجة تشريح مع ملقط واحد وسحب بعيدا أقراص هوائي الدماغ والعين مع ملقط أخرى.
ملاحظة: الحفاظ على تشريح العقول لوضعها بالقرب من أقراص الجناح التصويري. تعمل الأدمغة كمنصة تمنع الغطاء من سحق أقراص الجناح التصويرية. - لعزل أقراص الجناح imaginal عقد أسفل نهاية الأنسجة تشريح مع ملقط واحد وخدش بلطف جدار الجسم وتمزيق الأقراص مع ملقط أخرى.
ملاحظة: إذا كان من الصعب العثور على أقراص الجناح التصويري، قشر القصبة الهوائية من الخلفي إلى الجانب الأمامي. أقراص الجناح التصويري التمسك القصبة الهوائية. - تغطية بلطف أقراص imaginal مع غطاء وختم مع طلاء الأظافر. مخزن في 4 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wako | 162-19321 | |
| TritonX-100 | Wako | 168-11805 | |
| Formaldehyde | Wako | 064-00406 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| normal goat serum | Sigma | G6767 | |
| mounting medium, Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| mouse-anti-Dlg 4F3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203 | dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3A6B4, RRID:AB_579780 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3B8D12, RRID:AB_579781 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 5H7B11, RRID:AB_579779 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-atubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | AA4.3, RRID:AB_579793 | dilute in PBTG, 1:100 |
| Alexa Fluor 546 Phalloidin | Molecular probes | A22283 | dilute in PBS, 1:40 |
| goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546 | Molecular probes | A11030 | dilute in PBTG, 1:400 |
| Fly strains | |||
| sd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #8609 | recombined with UAS-EGFP |
| upd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #26796 | recombined with UAS-EGFP |
| UAS-lgl-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #51247 | |
| UAS-scrib-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #105412 | |
| UAS-RasV12 | Bloomington Drosophila Stock Center | #64196 | |
| UAS-Yki3SA | Bloomington Drosophila Stock Center | #28817 | |
| hsFLP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6 | |
| Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4) | Bloomington Drosophila Stock Center | #4780 | recombined with UAS-EGFP |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #5428 | X chromosome |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6658 | third chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24650 | second chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24651 | third chromosome |
| vkg-GFP | Morin et al. 2001 | GFP protein trap |
