Overview
染色 德罗索菲拉 假想光盘时，通常在光盘暴露但仍附着在身体上时进行粗略解剖。一旦染色，感兴趣的光盘被隔离并安装。示例协议演示了机翼假想光盘解剖和安装的程序。
Protocol
本协议摘自森本和田森，诱导和诊断肿瘤在 德罗索菲拉 想象光盘埃皮塞利亚，J.Vis.Exp.（2017 年）。
1. 拉瓦的解剖
- 用木棍或钝钳收集游荡的第三只星内幼虫，用适当的荧光标记（如EGFP）在荧光立体显微镜下对它们进行基因型，并把它们放在带有PBS（磷酸盐缓冲盐水）的解剖盘中。
- 用 2 mL 塑料转移移液器用管道清洗 PBS 中的幼虫。
- 用一个钳子捏幼虫的中心，用另一个钳子把身体撕成两半。
- 用一个钳子捏住前半部分的嘴钩，用另一个钳子将嘴推向身体，将身体从内到外转动。
- 去除不必要的材料，如唾液腺或脂肪体与钳子。
2. 固定和抗体染色
- 将解剖过的幼虫体前半部分（包括假想的翼盘）转移到 1.5 mL 塑料管中，并在 1 mL 的修复溶液（PBS 中的 4% 甲醛）中固定 10 分钟，在黑暗中的室温下轻轻旋转。
注意事项： 甲醛是有毒的，具有致癌的潜力。戴防护手套和衣服，防止皮肤接触。
注： 在此部分中，除非另有说明，否则所有步骤均在室温下在黑暗中的螺母上进行。 - 删除修复解决方案并丢弃。用 1 mL PBT（PBS 中的 0.3% Triton X-100）清洗组织三次，每次 15 分钟。
- 去除 PBT 并添加 1 mL 的 PBTG（0.2% 牛血清白蛋白和 5% 普通山羊血清在 PBT 中），用于在室温下或在 4 °C 下过夜时阻塞和坚果 1 小时。
- 取出 PBTG 并添加与 PBTG 适当稀释的主要抗体溶液（参见 材料表），并在 4 °C 下通宵发芽。
- 取出主要抗体溶液，用 1 mL PBT 清洗组织三次，每次 15 分钟。
- 删除 PBT 并添加与 PBTG 适当稀释的二次抗体溶液 （1：400）。在室温下或在 4 °C 下过夜 2 小时。
- 取出二次抗体溶液，用 1 mL PBT 清洗组织两次，每次 15 分钟。
- 要染色 F-actin，删除 PBT 并在 PBS （1：40） 中适当稀释添加法乐蛋白溶液。然后坚果20分钟。取出法洛丁溶液，用 1 mL 的 PBT 清洗组织两次，每次 15 分钟。
- 为了对抗核DNA，删除 PBT 并添加 DAPI（4'，6-迪亚米迪诺-2-苯林多）溶液（PBS 中的 DAPI 0.5μg/mL）。然后坚果10分钟。
注意事项： DAPI具有致癌潜力。戴防护手套和衣服，防止皮肤接触。 - 取出 DAPI 溶液，用 1 mL PBT 洗涤组织两次，每次 15 分钟。
- 在室温下，在 1 mL 的 PBS 中冲洗一次 10 分钟。
- 删除 PBS 并添加 500 μL 的 100% 甘油作为预安装介质。
3. 安装到显微镜幻灯片上
- 使用 2 mL 塑料转移移液器将染色组织放在显微镜滑梯上。
- 将组织转移到另一个显微镜幻灯片上的安装介质滴与钳子。
- 用一个钳子按住解剖组织的末端，用另一个钳子拉开大脑和眼睛的天线盘。
注： 保持解剖的大脑，把他们靠近翅膀想象光盘。大脑充当一个平台，防止盖片粉碎机翼想象光盘。 - 分离机翼想象光盘用一个钳子按住解剖组织的末端，轻轻划伤身体壁，用其他钳子撕下圆盘。
注： 如果很难找到机翼想象光盘，请将气管从后部剥离到前侧。翼想象光盘粘在气管上。 - 用盖子轻轻盖住假想的圆盘，用指甲油密封：存储在4°C。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wako | 162-19321 | |
| TritonX-100 | Wako | 168-11805 | |
| Formaldehyde | Wako | 064-00406 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| normal goat serum | Sigma | G6767 | |
| mounting medium, Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| mouse-anti-Dlg 4F3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203 | dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3A6B4, RRID:AB_579780 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3B8D12, RRID:AB_579781 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 5H7B11, RRID:AB_579779 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-atubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | AA4.3, RRID:AB_579793 | dilute in PBTG, 1:100 |
| Alexa Fluor 546 Phalloidin | Molecular probes | A22283 | dilute in PBS, 1:40 |
| goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546 | Molecular probes | A11030 | dilute in PBTG, 1:400 |
| Fly strains | |||
| sd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #8609 | recombined with UAS-EGFP |
| upd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #26796 | recombined with UAS-EGFP |
| UAS-lgl-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #51247 | |
| UAS-scrib-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #105412 | |
| UAS-RasV12 | Bloomington Drosophila Stock Center | #64196 | |
| UAS-Yki3SA | Bloomington Drosophila Stock Center | #28817 | |
| hsFLP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6 | |
| Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4) | Bloomington Drosophila Stock Center | #4780 | recombined with UAS-EGFP |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #5428 | X chromosome |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6658 | third chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24650 | second chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24651 | third chromosome |
| vkg-GFP | Morin et al. 2001 | GFP protein trap |
