האי Assay: שיטת תפוקה גבוהה כדי להעריך את התנהגותו של דרוזופילה לוקומוטור

Overview

סרטון זה מתאר את מבחני האי, שיטה התנהגותית המשמשת לחקר תנועה של דרוזופילה. הפרוטוקול לדוגמה כולל הגדרה עבור התואם לבדיקה עם ניתוח תמונה אוטומטי למחצה.

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Eidhof et al., ניתוח תפוקה גבוהה של התנהגות לוקומוטור באי דרוזופילה Assay, J. Vis. Exp. (2017).

1. בניית קופסת אסאי האי

1. הכן מגש עשוי מחומר חזק, כגון פולי מתיל מתקרילט (PMMA), כדי להכיל שכבת מים(כלומר אמבטיה). ודא שהחומר אינו לבן.
   שים לב: מידות של 40 x 35 x 2.5 ס"מ³ מומלצות (איור 1A).
2. הכינו תיבה (42 x 38 x 25 ס"מ³⁾העשויה מחומר חזק ושקוף, כגון PMMA, שיוצב סביב האמבטיה כדי למנוע מהזבובים לברוח לחלל המעבדה. הניחו חור (20 x 30 ס"מ²⁾בצד הצדדי הגדול מספיק כדי שהניסוי יטפל בקלות בבקבוקונים עם זבובים ויפיל אותם על האי(איור 1A).
3. הכן פלטפורמה מוגבהת 10 x 15 x^2.5 ס"מ 3 בממד, עשוי מחומר אטום (PMMA או פלסטיק) כי הוא אטום למים.
   שים לב: פלטפורמה זו נדרשת להיות בעלת משטח לבן אחיד כדי להבטיח ניגודיות טובה לניתוח תמונה. הגודל לא בהכרח קבוע, אבל הוא צריך להיות גדול מספיק כדי לוודא שכל הזבובים נוחתים בתחילה על הרציף ולקבל את ההזדמנות ללכת עליו (איור 1A).
4. לתקן את הפלטפורמה על ידי הדבקתו לאמבטיה או הצבת משקולות או חפצים כבדים אחרים בתוך תיבת הפלטפורמה כדי למנוע שינויים מיקום של הפלטפורמה במהלך הפגישה ניסיוני / צילום.

2. דרישות תוכנה והתקנה

1. התקנת תוכנה להקלטת תמונות.
   1. הורד תוכנה להקלטת תמונות כדי להקליט את סדרת התמונות של האי (עיין בטבלת החומרים)והתקן את התוכנה במחשב.
      שים לב: תוכנת הקלטת הדימות המתוארת בפרוטוקול זה נתמכת על-ידי Windows בלבד. חלופה עבור משתמשים אחרים נוספה לטבלת החומרים.

3. הכנת הזבובים להיבדק באי Assay

1. לאסוף זבובים מבוימים עבור כל מצב ניסיוני תחת הצטננות או פחמן דו חמצני (CO₂₎הרדמה, כפי שתואר קודם לכן (על פני תקופה של 1 - 2 ימים).
   1. הכינו מינימום של 3 בקבוקונים לדוגמה לכל מצב ניסיוני, שכל אחד מהם מכיל כ-15 זבובים מבוימים. יש להשתמש רק בזבובים עם כנפיים שלמות, בני גיל ומין דומים.
      שים לב: לניסויים המתוארים כאן, 5 בקבוקונים מדגם המכיל 15 זבובים זכרים של הגנוטיפים w^{- ;} אקטין-גל4/+ (בקרה)^{ו-w - ;} Actin-Gal4/GD11950 (tefu RNAi) נאספו ביום ההקלה, בגיל 4 ימים, ושימשו לביצוע מבחני האי. RNAi, זני בקרה, ואת הנהג Actin-gal4 התקבלו ממקור מסחרי (ראה טבלה של חומרים).
2. תן לזבובים להתאושש כדי למנוע השפעות מההרדמה (לפחות יום אחד בעת שימוש ב- CO₂) לפני בדיקת הזבובים שנאספו בבדיקת האי בגיל העניין.

4. התקנה ניסיונית

שים לב: ראו איור 1B.

1. מוסיפים מים קרים עם כמות קטנה של סבון למגש האמבטיה וממקמים את הפלטפורמה באמצע.
   שים לב: הסבון מקטין את מתח פני השטח של המים; זבובים שנוגעים במים יטבעו. זה מונע כמויות הולכות וגדלות של זבובים עפים בתיבה במהלך התקדמות הפגישה הניסיונית.
2. מניחים את התיבה השקופה על גבי המגש ומאירים את הפלטפורמה מלמעלה באמצעות מנורה.
   שים לב: תאורת הפלטפורמה נדרשת בעיקר כדי להבטיח ניגודיות וידאו נאותה. נורית LED רגילה של 12 וולט מתאימה לכך.
3. מקם את מצלמת האינטרנט ישירות מעל הפלטפורמה (מחוץ לקופסה) וחבר אותה למחשב.
4. צור תיקיות חדשות במחשב כדי לאחסן את הנתונים הניסיוניים השונים לפני הניסויים.
   1. עקבו אחר מבנה הדוגמה המאויר באיור 2א' ליצירת התיקיות. לדוגמה, אם התכנון הניסיוני דורש בדיקת שני גנוטיפים עם חמישה שכפולים כל אחד, צור תחילה תיקיה ראשית המכילה את תאריך הניסוי. בתוך התיקיה הראשית, צור שתי תיקיות משנה (אחת לכל גנוטיפ). בתוך תיקיות הגנוטיפ, צור חמש תיקיות משנה חדשות, אחת לכל שכפול.
      שים לב: לצורך ניתוח נוסף, חיוני שסדרת התמונות המתאימה לניסויים בודדים תישמר בתיקיות עם שמות ייחודיים.

5. הגדרת הגדרות וידאו בסעיף "לכידת התקן" של הממשק

1. פתח את התוכנה להקלטת תמונות, ותחת הכרטיסייה "לכידה", לחץ על "תמונות לשגות בזמן..." ובחר את מצלמת האינטרנט המתאימה כ"התקן הלכידה".
2. הניחו זבוב מת על האי; להתאים את הגדרות הווידאו על ידי לחיצה על התיבה "הגדרות וידאו". גללו בין סרגלי הכלים, תוך התאמת הבהירות, הניגודיות והצבע באופן שהעף המת יופיע בשחור על רקע לבן (איור 2B). לאחר השלמת ההתאמות, לחץ על "אישור".

6. הגדרת הגדרות הקלטה ושמירת וידאו בסעיף "זמן לשגות" של הממשק

1. התאם את ההגדרות ב"הגדרת סרט לשגות בזמן" כדי לשמור את הניסוי כקובץ .avi. לחץ על "עיון...", בחר את הספריה שבה הסרט יאוחסן, להגדיר את שם הווידאו, ולחץ על "שמור".
   שים לב: קובץ הווידאו אינו משמש לכימות נתונים; עם זאת, זה עשוי להיות שימושי כדי לקבל מושג כללי על הניסוי.
2. התאם את ההגדרות בסעיף 'הגדרת סרט לשגות בזמן'.
   1. בתיבת הדחיסה, בחר "קוד Intel IYUV" לדחיסת וידאו ובחר "קח מסגרת אחת כל 0.1 שניות", עם "קצב הפעלה חוזרת (תמונות לשנייה):" בגיל 10.
   2. שמור את סדרת הזמן של הניסוי כמסגרות .bmp על ידי לחיצה על "מתקדם..." בחר "צור תמונה .bmp עבור כל מסגרת שנלכדה". לחץ על "עיון". בחר באותה ספריה בחלון "במהלך לכידת סרט AVI" (כפי שנבחר בשלב 6.1), לחץ על "פתח" ולחץ על "אישור".
      שים לב: שים לב שבמהלך הניסוי, המסגרות מאוחסנות כקבצי .bmp (נדרש לניתוח נתונים). התוכנית מכנה את המסגרות כ- "A" ואחריהן את המספר המתאים לרצף לכידת המסגרות (למשל, "A_number.bmp")(איור 2C). שמור תמיד את התמונות השייכות לניסויים שונים בתיקיה חדשה כדי להבטיח שסדרת תמונות שהוקלטה בעבר לא תוחלפו. שים לב שהתמונות אינן נשמרות באופן אוטומטי באותה תיקיה שבה נמצא קובץ הווידאו, אלא אם תיקיה זו נבחרת תחת "עיון..." בעת לחיצה על התיבה "מתקדם".

7. האי אסאי ואיסוף נתונים

1. לחץ על לחצן התחל בממשק התמונה לשגות בזמן של התוכנה להקלטת תמונות כדי להתחיל את ההקלטה.
2. הקש על בקבוקון הניסוי המכיל זבובים (שלב 3) 2-3 פעמים כדי להבטיח כי זבובים נמצאים בתחתית הבקבוקון. הסר במהירות את התקע של הבקבוקון, ובתנועה נמרצת, הקש על הבקבוקון על הרציף כך שכל הזבובים ייפלו על הרציף בו-זמנית(איור 1C).
3. לאחר כ- 30 שניות, לחץ על לחצן "עצור" כדי להפסיק את ההקלטה.
   שים לב: אם כל הזבובים נעלמים מהרציף, ניתן לעצור את ההקלטה מוקדם יותר.
4. הסר את הזבובים שנותרו במשך 30 שניות על הפלטפורמה ביד לאחר עצירת הקלטת התמונה.
5. לפני שתמשיך להקליט את הניסוי הבא, שנה את ספריית היעד עבור .bmp קבצים וסרטים (ראה סעיף 6).

Representative Results

איור 1: תרשים זרימה המתאר את הדרישות, ההליך הניסיוני וניתוח מבחני האי. (A)ציוד בדיקה של האי. (B)התקנה ניסיונית עבור מבחני האי. (ג)מבחני האי. (D)עיבוד נתוני מבחני האי עם המאקרו"Drosophila Island Assay". המאקרו"Drosophila Island Assay" מורכב משלוש פקודות מאקרו משניות: 1) מבצעות ניתוח של ערימה והקרנה, 2) מגדירות פלטפורמה ו- 3). (ה)עיבוד והערכה סטטיסטית של נתונים באמצעות סקריפט "ניתוח אסאי האי". לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: דוגמאות להתאמות שונות הנדרשות במהלך הפרוטוקול. (A)מבנה הספריות הנדרש שבו יש לאחסן ניסויים ב-Island assay לעיבוד וניתוח נתונים. (B) בעת התאמת הגדרות הווידאו, זבובים חייבים להופיע בשחור על רקע לבן. (C) קבצי פלט של מסגרת תמונה כפי שנשמרו על ידי תוכנת הקלטת התמונה המתוארת בכתב יד זה. (ד)החלוקה לרמות הצהובה מציגה את בחירת הפלטפורמה. בחירת הפלטפורמה המאוחסנת ב"מנהל ההחזרים על ההשקעה" מסומנת בכחול. (E)זבובים מיוצגים כנקודות לבנות במהלך ההתאמה של "הגדרת גודל זבוב מינימלי". חלון התוצאות מציג את אזור הזבובים בפיקסלים. (F) דוגמה למסגרת תמונה מוקלטת יחידה (משמאל) ולמסגרת המתאימה בערימת התמונה המתקבלת, המתקבלת באמצעות המאקרו"Drosophila Island Assay" (מימין). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 x 95 mm Drosophila vials	Flystuff	32-116SB	-
Logitech C525 HD Webcam	Logitech	-	Any webcam with USB connection is suitable.
Stand to hold webcam	-	-	-
Lamp	-	-	12 V LED lights are appropriate
Pounding pad	-	-	Any mouse pad works
Island Assay box	-	-	Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent.
Island Assay bath	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Non white.
Island/platform	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white.
Soap	-	-	Standard dishwashing detergent is suitable.
Computer	-	-	Scripts run both on Windows and Mac
Image-recording software: HandiAvi®	AZcendant®	-	HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0)
Image-recording software: WebcamCapture	-	-	Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the "Drosophila Island Assay" macro on this data, no text should be present in the "First frame identifier" setting.