島のアッセイ: ショウジョウバエ ・ロコ運動行動を評価するハイスループット法

Overview

このビデオでは、 ショウジョウバエ の移動を研究するために使用される行動方法である島のアッセイについて説明します。サンプルプロトコルは半自動画像分析と互換性があるアッセイのためのセットアップを特色にする。

Protocol

このプロトコルは、ヨウジョウバエ島アッセイ、J.Vis.Exp.(2017)におけるロコモド挙動のハイスループット分析からの抜粋です。

1. 島のアッセイボックスの建設

1. ポリメチルメタクリレート(PMMA)などの堅牢な材料で作られたトレイを準備し、水の層(すなわち 、お風呂)を含めます。材料が白でないことを確認します。
   注: 40 x 35 x 2.5 cm³ の寸法を推奨します (図 1A)。
2. ハエが実験室の空間に逃げるのを防ぐために、PMMAなどの堅牢で透明な材料で作られた箱(42 x 38 x 25 cm³⁾をバスの周りに置く準備をします。実験者がハエでバイアルを簡単に扱い、島に落とすのに十分な大きさの側面に穴(20 x 30 cm²⁾を置いて、島に落とします(図1A)。
3. 水密性の不浸透性材料(PMMAまたはプラスチック)で作られた次元の高いプラットホーム10 x 15 x 2.5 cm³ を準備する。
   注:このプラットフォームは、画像解析に適したコントラストを確保するために、均一な白色表面を持つ必要があります。サイズは必ずしも固定されていませんが、すべてのハエが最初にプラットフォーム上に着陸し、その上を歩く機会を得るのに十分な大きさでなければなりません(図1A)。
4. 実験/撮影セッション中にプラットフォームの位置変更を防ぐために、お風呂に入れるか、プラットフォームボックス内に重みや他の重いオブジェクトを配置することによって、プラットフォームを修正します。

2. ソフトウェア要件とインストール

1. 画像記録ソフトウェアのインストール。
   1. 画像記録ソフトウェアをダウンロードして、島のイメージシリーズを記録し( 資料表を参照)、コンピュータにインストールします。
      注: このプロトコルで説明されているイメージング記録ソフトウェアは、Windows でのみサポートされています。他のユーザーの代わりに 、材料表に追加されました。

3. 島アッセイでテストされるハエの準備

1. 前に述べたように、寒冷または二酸化炭素_(CO2)麻酔下の各実験条件に対して段階的なハエを収集します(1〜2日間にわたって)。
   1. 実験条件ごとに最低3個のサンプルバイアルを用意し、それぞれに約15個のステージハエを含む。無傷の翼を持ち、年齢や性別が似ているハエのみを使用してください。
      注: ここで説明する実験では、15個の雄ハエを含む5つのサンプルバイアルw^-;アクチンギャル4/+(コントロール)とw^-;アクチン・Gal4/GD11950(テフRNAi)は、4日間熟成したエクロションの日に回収し、島のアッセイを行うために使用した。RNAi、コントロール株、およびアクチンギャル4ドライバは、商業的な情報源から入手した( 資料表を参照)。
2. ハエは、対象年齢で島のアッセイで収集されたハエをテストする前に、麻酔薬(CO₂を使用する場合は少なくとも1日)からの影響を避けるために回復させてください。

4. 実験的なセットアップ

注:図 1Bを参照してください。

1. 少量の石鹸を入れた冷たい水をバストレイに加え、プラットフォームを真ん中に置きます。
   注: 石鹸は水の表面張力を減少させます。水に触れるハエが溺れる。これにより、実験セッションの進行中に箱の中を飛ぶハエの量が増えないようにします。
2. 透明なボックスをトレイの上に置き、ランプを使用して上からプラットフォームを照らします。
   注: プラットフォームの照明は、主に適切なビデオコントラストを確保するために必要とされます。通常の12-V LEDライトはこれに適しています。
3. Web カメラをプラットフォームの真上 (ボックスの外側) に配置し、コンピューターに接続します。
4. 実験の前に、さまざまな実験データを保存するために、コンピュータ上に新しいフォルダを作成します。
   1. 図 2Aに示されている例の構造に従って、フォルダを作成します。たとえば、実験計画でそれぞれ 5 つの反復を持つ 2 つの遺伝子型をテストする必要がある場合は、まず実験の日付を含むメイン フォルダーを作成します。メイン フォルダ内に 2 つのサブフォルダを作成します(1 つのサブフォルダーを作成します)。genotype フォルダ内に、複製ごとに 1 つずつ、新しいサブフォルダを 5 つ作成します。
      注: さらなる分析のためには、個々の実験に対応する画像シリーズを一意の名前のフォルダに保存することが不可欠です。

5. インターフェイスの「キャプチャ デバイス」セクションでビデオ設定を設定します。

1. 画像記録ソフトウェアを開き、[キャプチャ]タブで[タイムラプス画像.]をクリックします。をクリックし、適切なウェブカメラを「キャプチャデバイス」として選択します。
2. 島に死んだハエを置く。[ビデオ設定]ボックスをクリックして、ビデオ設定を調整します。ツール バーをスクロールして、白い背景にデッド フライが黒く表示されるよう、明るさ、コントラスト、および色を調整します (図 2B)。調整が完了したら、[OK] をクリックします。

6. インターフェイスの「タイムラプス」セクションでの録画とビデオ保存の設定の設定

1. 「タイムラプスムービー設定」の設定を調整して、実験を.aviファイルとして保存します。「ブラウズ..」をクリックし、ムービーが保存されるディレクトリを選択し、ビデオの名前を定義して「保存」を押します。
   注: ビデオファイルはデータの定量化には使用されません。ただし、実験に関する全体的なアイデアを得ると便利な場合があります。
2. 「タイムラプスムービーの設定」セクションで設定を調整します。
   1. 圧縮ボックスで、ビデオ圧縮用の「インテル IYUV コード」を選択し、「1 フレームを 0.1 秒ごとに取る」を選択し、「再生率 (1 秒あたりのイメージ):」を 10 にします。
   2. 「詳細」をクリックして、実験時系列を.bmpフレームとして保存します。「キャプチャされたフレームごとに.bmpイメージを作成する」を選択します。「参照」をクリックします。「AVIムービーキャプチャ中」ウィンドウで同じディレクトリを選択し(「開く」をクリックして「OK」を押します)。
      注: 実験中にフレームは.bmpファイルとして保存されます(データ分析に必要)。プログラムは、フレームの名前を「A」とし、フレームキャプチャシーケンスに対応する番号(例えば、「A_number.bmp」)を付けます(図2C)。以前に記録した画像シリーズが上書きされないように、常に異なる実験に属する画像を新しいフォルダに保存します。[参照]の下でこのフォルダを選択しない限り、画像はビデオファイルと同じフォルダに自動的に保存されないことに注意してください。[詳細設定] ボックスをクリックすると、そのオプションをクリックします。

7. 島のアッセイとデータ収集

1. 画像記録ソフトウェアのタイムラプス画像インターフェースの開始ボタンを押して、記録を開始します。
2. ハエを含む実験バイアル(ステップ3)を2〜3回タップして、ハエがバイアルの底にあることを確認します。バイアルのプラグを素早く取り外し、激しい動きでプラットフォーム上のバイアルをタップして、すべてのハエが同時にプラットフォームに落下するようにします(図1C)。
3. 約30sの後、「停止」ボタンを押して録音を停止します。
   注: すべてのハエがプラットフォームから消えた場合、録音は早く停止することができます。
4. 画像記録を停止した後、プラットフォーム上に30の残っているハエを手で取り除きます。
5. 次の実験の記録に進む前に、.bmpファイルとムービーのターゲットディレクトリを変更します(セクション6を参照)。

Representative Results

図1:島のアッセイの要件、実験手順、および分析を概説するフローチャート。(A)島のアッセイ機器。(B) 島のアッセイの実験(C)島のアッセイ。(D) ショウジョウバエ島アッセイマクロを用いた島のアッセイデータの処理「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロは、3つのサブマクロで構成されています:1)スタックと投影を作成し、2)プラットフォームを定義し、3)分析。(E)「アイランドアッセイ解析」スクリプトを用いたデータの処理と統計評価この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:プロトコル中に必要なさまざまな調整の例(A)島のアッセイ実験をデータ処理と解析のために保存する必要があるディレクトリ構造。(B)動画の設定を調整する場合、白い背景にハエが黒く表示される必要があります。(C)この原稿に記載された画像記録ソフトウェアによって保存された画像フレーム出力ファイル。(D) 黄色のアウトラインはプラットフォームの選択を示します。「ROIマネージャ」に保存されているプラットフォームの選択は青で強調表示されます。(E) ハエは「最小フライサイズ設定」の調整中に白い点で表されます。結果ウィンドウには、ハエの面積がピクセル単位で表示されます。(F)単一の記録された画像フレーム(左側)と得られた画像スタック内の対応するフレームの例は、「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロ(右側)で得られる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 x 95 mm Drosophila vials	Flystuff	32-116SB	-
Logitech C525 HD Webcam	Logitech	-	Any webcam with USB connection is suitable.
Stand to hold webcam	-	-	-
Lamp	-	-	12 V LED lights are appropriate
Pounding pad	-	-	Any mouse pad works
Island Assay box	-	-	Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent.
Island Assay bath	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Non white.
Island/platform	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white.
Soap	-	-	Standard dishwashing detergent is suitable.
Computer	-	-	Scripts run both on Windows and Mac
Image-recording software: HandiAvi®	AZcendant®	-	HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0)
Image-recording software: WebcamCapture	-	-	Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the "Drosophila Island Assay" macro on this data, no text should be present in the "First frame identifier" setting.