Öanalys: En metod med hög genomströmning för att utvärdera Drosophila Locomotors beteende

Overview

Denna video beskriver öns analys, en beteendemetod som används för att studera Drosophila-rörelse. Exempelprotokollet har en inställning för analysen som är kompatibel med halvautomatisk avbildningsanalys.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Eidhof et al., High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay, J. Vis. Exp. (2017).

1. Konstruktion av öns analyslåda

1. Förbered en bricka av ett robust material, såsom polymetylmetylmetylrylat (PMMA), för att innehålla ett lager vatten(dvs. ett bad). Se till att materialet inte är vitt.
   OBS: Måtten 40 x 35 x 2,5 cm³ rekommenderas (figur 1A).
2. Förbered en låda (42 x 38 x 25 cm³) tillverkad av ett robust, transparent material, såsom PMMA, som ska placeras runt badet för att förhindra att flugorna läcker ut i laboratorieutrymmet. Placera ett hål (20 x 30 cm²) på sidosidan som är tillräckligt stort för att experimenteraren enkelt ska kunna hantera flaskorna med flugor och släppa dem på ön (Figur 1A).
3. Förbered en förhöjd plattform 10 x 15 x 2,5 cm³ i dimension, tillverkad av ett ogenomträngligt material (PMMA eller plast) som är vattentätt.
   OBS: Denna plattform krävs för att ha en enhetlig vit yta för att säkerställa god kontrast för bildanalys. Storleken är inte nödvändigtvis fixerad, men den bör vara tillräckligt stor för att se till att alla flugor initialt landar på plattformen och får chansen att gå på den (Figur 1A).
4. Fixa plattformen genom att antingen limma in den i badet eller placera vikter eller andra tunga föremål inuti plattformslådan för att förhindra positionsförändringar på plattformen under experiment-/filmsessionen.

2. Programvarukrav och installation

1. Installation av programvara för bildinspelning.
   1. Ladda ner bildinspelningsprogram för att spela in öns bildserie (se materialförteckningen)och installera programvaran på en dator.
      OBS: Bildinspelningsprogrammet som beskrivs i det här protokollet stöds bara av Windows. Ett alternativ för andra användare har lagts till i materialförteckningen.

3. Förberedelse av flugorna som ska testas i öanalysen

1. Samla iscensatta flugor för varje experimentellt tillstånd under kall eller koldioxid (CO₂₎anestesi, som tidigare beskrivits (under en period av 1- 2 dagar).
   1. Förbered minst 3 prov injektionsflaska per experimentellt tillstånd, var och en innehållande cirka 15 stegade flugor. Använd endast flugor med intakta vingar och som är av liknande ålder och kön.
      OBS: För de experiment som beskrivs här, 5 prov injektionsflaska som innehåller 15 manliga flugor av genotyperna w^-; Actin-Gal4/+ (kontroll) och w^-; Actin-Gal4/GD11950 (tefu RNAi) samlades in på dagen för eklosion, åldrats i 4 dagar, och användes för att utföra öanalysen. RNAi, kontrollstammar och Actin-gal4-föraren erhölls från en kommersiell källa (se materialförteckningen).
2. Låt flugorna återhämta sig för att undvika effekter från bedövningsmedel (minst 1 dag vid användning av CO₂) innan de insamlade flugorna testas i ö-analysen vid en ålder av intresse.

4. Experimentell installation

OBS: Se figur 1B.

1. Tillsätt kallt vatten med en liten mängd tvål till badbrickan och placera plattformen i mitten.
   OBS: Tvålen minskar vattnets ytspänning; flugor som vidrör vattnet kommer att drunkna. Detta förhindrar ökande mängder flugor som flyger i lådan under progressionen av den experimentella sessionen.
2. Placera den genomskinliga lådan ovanpå brickan och tänd plattformen ovanifrån med hjälp av en lampa.
   OBS: Belysning av plattformen krävs främst för att säkerställa korrekt videokontrast. En vanlig 12-V LED-lampa är lämplig för detta.
3. Placera webbkameran direkt ovanför plattformen (utanför lådan) och anslut den till en dator.
4. Skapa nya mappar på datorn för att lagra de olika experimentella data före experimenten.
   1. Följ strukturen i exemplet som illustreras i figur 2A för att skapa mapparna. Om den experimentella designen till exempel kräver att två genotyper testas med fem replikat vardera skapar du först en huvudmapp som innehåller datumet för experimentet. I huvudmappen skapar du två undermappar (en per genotyp). I genotypmapparna skapar du fem nya undermappar, en per replikerad.
      OBS: För ytterligare analys är det viktigt att bildserien som motsvarar enskilda experiment sparas i mappar med unika namn.

5. Installation av videoinställningar i avsnittet "Capture Device" i gränssnittet

1. Öppna bildinspelningsprogramvaran och klicka på "Time-Lapse Images..." under fliken "Capture". och välj lämplig webbkamera som "Capture Device".
2. Placera en död fluga på ön; justera videoinställningarna genom att klicka på rutan "Videoinställningar". Bläddra igenom verktygslisterna, justera ljusstyrka, kontrast och färg på ett sådant sätt att den döda flugan ser svart ut på en vit bakgrund (bild 2B). När justeringarna är klara klickar du på "Ok".

6. Inställningar för inspelning och sparande av video i avsnittet "Tidsfördröjning" i gränssnittet

1. Justera inställningarna i filminstallationen "Time-Lapse Movie Setup" för att spara experimentet som en .avi fil. Klicka på "Bläddra...", välj katalogen där filmen ska lagras, definiera namnet på videon och tryck på "spara".
   OBS: Videofilen används inte för kvantifiering av data. Det kan dock vara användbart att få en övergripande uppfattning om experimentet.
2. Justera inställningarna i avsnittet "Filminstallation för tidsfördröjning".
   1. I komprimeringsrutan väljer du "Intel IYUV-kod" för videokomprimering och väljer "Ta en bildruta var 0,1 sekund", med "Uppspelningsfrekvens (bilder per sekund):" vid 10.
   2. Spara experimenttidsserien som .bmp ramar genom att klicka på "Avancerat..." Välj "Skapa en .bmp för varje fångad bildruta". Klicka på "Bläddra". Välj samma katalog i fönstret "Under AVI-filminspelning" (som valts i steg 6.1), klicka på "Öppna" och tryck på "Ok".
      OBS: Observera att under experimentet lagras ramarna som .bmp filer (krävs för dataanalys). Ramarna namnges som "A" följt av det tal som motsvarar bildinfångstsekvensen (t.ex."A_number.bmp") (figur 2C). Spara alltid bilderna som tillhör olika experiment i en ny mapp för att säkerställa att tidigare inspelade bildserier inte skrivs över. Var medveten om att bilderna inte sparas automatiskt i samma mapp som videofilen om inte den här mappen är markerad under "Bläddra..." när du klickar på rutan "Avancerat".

7. Ö-analys och datainsamling

1. Tryck på startknappen i bildgränssnittet för bildinspelning för att starta inspelningen.
2. Knacka på den experimentella injektionsflaskan som innehåller flugor (steg 3) 2-3 gånger för att säkerställa att flugorna är i botten av injektionsflaskan. Ta snabbt bort injektionsflaskan och knacka snabbt på injektionsflaskan på plattformen med en kraftig rörelse så att alla flugor faller på plattformen samtidigt (bild 1C).
3. Efter cirka 30 s trycker du på "Stop"-knappen för att stoppa inspelningen.
   OBS: Om alla flugor försvinner från plattformen kan inspelningen stoppas tidigare.
4. Ta bort flugorna som finns kvar i 30 s på plattformen för hand efter att ha stoppat bildinspelningen.
5. Innan du fortsätter att spela in nästa experiment ändrar du målkatalogen för .bmp filer och filmer (se avsnitt 6).

Representative Results

Figur 1: Flödesschema som beskriver kraven, försöksförfarandet och analysen av öanalysen. A)Ö-analysutrustning. B)Experimentell inställning för ö-analysen. C)Ö-analys. D)Bearbetning av öanalysdata med makrot"Drosophila Island Assay". Makrot "Drosophila Island Assay " består av 3 delmakron: 1) gör stack och projektion, 2) definiera plattform och 3) analys. e)Bearbetning och statistisk utvärdering av uppgifter med hjälp av skriptet "Ö-analysanalys". Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 2: Exempel på olika justeringar som krävs under protokollet. A)Den katalogstruktur i vilken öanalysförsök måste lagras för databehandling och analys. (B) Vid justering av videoinställningarna måste flugor se svarta ut på en vit bakgrund. (C) Bildramutmatningsfiler som sparats av bildinspelningsprogramvaran som beskrivs i detta manuskript. (D) Den gula konturen visar plattformsvalet. Det lagrade plattformsvalet i "ROI Manager" markeras i blått. (E) Flugor representeras som vita prickar under justeringen av inställningen "Minsta flygstorlek". Resultatfönstret visar området för flugorna i pixlar. (F) Exempel på en enda inspelad bildram (till vänster) och motsvarande bildram i den resulterande bildstacken, erhållna med makrot "Drosophila Island Assay " (till höger). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 x 95 mm Drosophila vials	Flystuff	32-116SB	-
Logitech C525 HD Webcam	Logitech	-	Any webcam with USB connection is suitable.
Stand to hold webcam	-	-	-
Lamp	-	-	12 V LED lights are appropriate
Pounding pad	-	-	Any mouse pad works
Island Assay box	-	-	Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent.
Island Assay bath	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Non white.
Island/platform	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white.
Soap	-	-	Standard dishwashing detergent is suitable.
Computer	-	-	Scripts run both on Windows and Mac
Image-recording software: HandiAvi®	AZcendant®	-	HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0)
Image-recording software: WebcamCapture	-	-	Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the "Drosophila Island Assay" macro on this data, no text should be present in the "First frame identifier" setting.