بروتوكول عمر لDrosophila melanogaster: توليد منحنيات البقاء على قيد الحياة لتحديد الاختلافات في طول العمر يطير

Overview

يستخدم العلماء بروتوكول عمر دروسوفيلا لقياس كيفية تأثير الظروف التجريبية المختلفة على طول عمر الذباب وتوليد منحنيات البقاء على قيد الحياة في هذه العملية لتحديد النتائج التجريبية. ويتميز بروتوكول العينة بالمقايسة التي يجري تطبيقها لدراسة الآثار على طول العمر من التعرض لتركيزات متفاوتة من المواد الكيميائية المسببة لاضطرابات الغدد الصماء، أو EDCs، مثل 17-α-ethinylestradiol (EE2).

Protocol

هذا البروتوكول مقتطف من Bovier et al., طرق لاختبار اضطراب الغدد الصماء في Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2019).

1. إعداد الطعام

1. للحفاظ على المخزون ونمو اليرقات ، استخدم وسيط دقيق الذرة الذي يحتوي على 3٪ من الخميرة المجففة ، و 10 ٪ سكروز ، و 9 ٪ دقيق الذرة المطبوخ مسبقا ، و 0.4 ٪ أجار ، وبعد ذلك يسمى متوسط دقيق الذرة (CM).
   1. ضعي 30 غ من الخميرة في 100 مل من ماء الصنبور، واغليها واتركيها تغلي لمدة 15 دقيقة.
   2. بشكل منفصل، اخلطي جيدا 90 غرام من دقيق الذرة المطبوخ مسبقا، و100 غرام من السكر، و4 غ من الأجار إلى 900 مل من ماء الصنبور.
   3. جلب الحل ليغلي، وخفض الحرارة ويطهى لمدة 5 دقائق اثارة باستمرار.
   4. بعد 5 دقائق، يضاف محلول الخميرة الساخنة ويترك على نار خفيفة لمدة 15 دقيقة أخرى.
   5. إيقاف مصدر الحرارة والسماح للحل لتبرد إلى حوالي 60 درجة مئوية.
   6. إضافة 5 مل / لتر من 10٪ ميثيل 4-هيدروكسيبنزوات في الإيثانول، مزيج جيدا والسماح لها الجلوس لمدة 10 دقيقة.
      ملاحظة: كن حذرا مع كمية الميثيل 4-هيدروكسي بينزوايت، بالنظر إلى أن تركيز كبير من مبيد الفطريات يمكن أن تكون قاتلة لليرقات.
   7. الاستغناء عن المتوسط في قوارير / زجاجات: 8 مل في كل قارورة ذبابة (25 ملم × 95 ملم)، 3 مل في كل قارورة ذبابة (22 ملم × 63 ملم) و 60 مل في كل زجاجة ذبابة (250 مل).
   8. قم بتغطية القنينات بفرش الجبن واتركها تجف في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 24 ساعة قبل التخزين.
   9. معايرة الاتساق الصحيح تجريبيا وترطيب CM عن طريق تعديل إما كمية أجار المستخدمة و / أو أوقات التبريد / التجفيف.
      ملاحظة: القنينات غير الموصولة والمحاصرة والمغلفة مستقرة لمدة 15 يوما عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
2. بالنسبة للبالغين Drosophila، استخدم وسيلة تحتوي على 10٪ من الخميرة المجففة، 10٪ سكروز، 2٪ أجار، تسمى بعد ذلك متوسط الكبار (AM).
   1. مزيج 10 غرام من مسحوق الخميرة، 10 غرام من السكروز، 2 غرام من أجار إلى 100 مل من الماء المقطر.
   2. جلب هذا الخليط ليغلي مرتين، مع فاصل زمني 3 دقائق، أو حتى يذوب أجار، وذلك باستخدام الميكروويف.
   3. بمجرد أن يبرد المحلول إلى 60 درجة مئوية ، أضف 5 مل / لتر من 10٪ ميثيل 4-hydroxybenzoate في الإيثانول ، واخلط جيدا والاستغناء في قوارير (10 مل لكل قارورة).
   4. تغطية القنينات مع قماش الجبن والسماح لهم الجافة في RT لمدة 24 ساعة قبل تخزينها.
      ملاحظة: القنينات غير الموصولة والمحاصرة والمغلفة مستقرة لمدة 15 يوما عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.

2. دروسوفيلا EDC التجريف

1. إعداد حل الأسهم المناسبة حل EDC مختارة في المذيبات المناسبة. لEE2 (الوزن الجزيئي 296.403)، حل 1.48 غرام في 10 مل من الإيثانول 100٪ لجعل محلول الأسهم 0.5 M وتخزينها في -80 درجة مئوية.
   تحذير: وتعتبر البلدان النامية الملوثة للبيئة وينبغي اتخاذ الاحتياطات اللازمة لمعالجتها.
2. تمييع محلول مخزون EE2 في الإيثانول بنسبة 10٪ في الماء (v/v) من أجل الحصول على محلول 100 mM. جعل التخفيف المقبل (0.1 mM، 0.5 mM و 1 mM) في الغذاء CM، بدءا من أدنى تركيز واستخدام نفس التركيز النهائي للمذيبات لكل مجموعة العلاج. لقنينات التحكم استخدام نفس حجم المذيب وحده.
   ملاحظة: يوصى بإبقاء التركيز النهائي للمذيب منخفضا قدر الإمكان ، مع الأخذ في الاعتبار أن التركيز النهائي للإيثانول يجب ألا يتجاوز 2٪ في طعام الذباب.
3. أضف المحلول الذي يحتوي على التمييع الصحيح ل EDC المحدد إلى الطعام القائم على دقيق الذرة قبل التماسك ، واخلط جيدا مع معالج الطعام ، والاستغناء عن 10 مل في قوارير ، وتغطية بالشاش القطني والسماح بالجفاف في RT لمدة 16 ساعة قبل الاستخدام.
   ملاحظة: استخدم هذه الوسيطة مباشرة بعد إعدادها.
4. للتربية الكبار، وإعداد مختلف حلول EE2 العمل (10 mM، 50 mM و 100 mM، على التوالي) في 10٪ الإيثانول في الماء (v/v) وطبقة 100 ميكرولتر من كل على سطح AM، من أجل الحصول على التركيز المطلوب من EE2 (0.1 mM، 0.5 mM و 1 mM). للتحكم استخدام نفس حجم المذيب وحده.
   ملاحظة: بدلا من ذلك، إضافة الحل الذي يحتوي على التخفيف الأيمن من EDC مختارة إلى كمية صغيرة من AM في أنبوب مخروطي 50 مل، دوامة بدقة وتراتبية 1 مل منه على سطح قارورة AM.
   1. تغطية القنينات مع شاش القطن، والسماح للتجفيف في RT لمدة 12-16 ساعة تحت التحريض لطيف واستخدامها على الفور.
      ملاحظة: يجب تعديل عملية التجفيف تجريبيا لأنها تعتمد على الرطوبة المحيطة.

3. تربية الذباب

1. استخدام سلالة متساوية المنشأ قوية، مثل أوريغون R، التي تحتفظ بها عدة أجيال في المختبر.
2. حافظ على الذباب في حاضنة رطبة يتم التحكم في درجة حرارتها ، مع ضوء طبيعي 12 ساعة: 12 ساعة ضوئية داكنة عند 25 درجة مئوية في قوارير تحتوي على طعام CM.
3. في كل مقايسة، استخدم القنينات في RT.

4. بروتوكول العمر الافتراضي

1. إعداد 20 قارورة من الذباب مع 8 إناث و 4 ذكور ومنزل في 25 درجة مئوية في CM (10 مل لكل منهما).
2. بعد 4 أيام تجاهل الذباب ووضع قوارير مرة أخرى في الحاضنة.
   ملاحظة: يمكن استخدام هذه الذبابات للبدء من جديد للحصول على أفواج أخرى متزامنة مع العمر من الذباب.
3. في وقت متأخر من بعد ظهر اليوم 9، وإزالة جميع الذباب eclosed حديثا من قوارير والعودة قوارير إلى الحاضنة.
   ملاحظة: يجب أن يبدأ عدد قليل من البالغين في eclose في وقت مبكر من اليوم التاسع. التخلص من هذه الذباب يسمح لجمع أكبر عدد ممكن من الذباب متزامنة، وتجنب اختيار الإهمال من الناشئة في وقت مبكر.
4. 16-24 ساعة في وقت لاحق, نقل الذباب الكبار (1 يوم من العمر) من كلا الجنسين إلى أربع مجموعات من زجاجات 250 مل تحتوي على المواد الغذائية AM تستكمل مع ثلاثة تركيزات EDC مختلفة واحدة مع المذيب وحده. إذا لزم الأمر، جمع دفعة أخرى في اليوم التالي.
5. الحفاظ على الذباب عند 25 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام للسماح لهم بالتزاوج.
   ملاحظة: يوم النقل إلى قارورات الطعام AM يتوافق مع اليوم الأول من مرحلة البلوغ.
6. بعد يومين إلى ثلاثة أيام، قم بفرز كل مجموعة من الذباب حسب الجنس إلى مجموعتين تحت تخدير_ثاني أكسيد الكربون الخفيف. تقسيم كل جنس بشكل عشوائي إلى خمس قوارير لكل علاج بكثافة 20 فردا لكل قارورة ، حتى يكون هناك ثلاث نسخ متماثلة من 5 قوارير متوازية لكل جنس لكل علاج.
   ملاحظة: العمل مع مجموعات صغيرة من الذباب من أجل منع المشاكل الصحية المحتملة طويلة الأمد بسبب وقت التعرض الطويل_لثاني أكسيد الكربون .
7. إعداد جدول بيانات العمر الذي يتم فيه طرح عدد الذباب الميت من عدد الذباب الباقي على قيد الحياة إلى النقل السابق ، بطريقة للحصول تلقائيا على عدد الناجين في كل عملية نقل.
8. نقل الذباب إلى قوارير جديدة تحتوي على الطعام المقابل كل 3 أيام في نفس الوقت والتحقق من الوفاة.
   ملاحظة: يجب أن يتم النقل دون تخدير يمكن أن يكون له تأثير سلبي طويل الأجل على طول عمر الذبابة.
   1. في كل عملية نقل، سجل عمر الذباب وعدد الذباب الميت.
      ملاحظة: يتم حساب عدد الذباب الباقي على قيد الحياة تلقائيا في جدول البيانات ولكن من المستحسن التحقق منه بصريا. ولا ينبغي النظر في الذباب الذي يهرب أو يموت بطريق الخطأ أثناء النقل. يجب الحرص على عدم عد الذباب الميت مرتين التي تم حملها إلى القارورة الجديدة التي تبلغ عن هذه الملاحظة في جدول البيانات.
   2. كرر الخطوتين 4.8 و 4.8.1 حتى يموت جميع الذباب.
9. لكل مجموعة علاج، إنشاء منحنى البقاء على قيد الحياة كما هو مبين في الشكل 1،من أجل عرض احتمال البقاء على قيد الحياة من ذبابة في أي وقت معين.
10. إجراء ثلاث تجارب مستقلة لكل مجموعة علاج الذباب، وذلك باستخدام 100 الذباب eclosed حديثا لكل تجربة.
11. إعداد جدول للإبلاغ عن متوسط العمر (متوسط أيام البقاء على قيد الحياة لجميع الذباب لكل مجموعة)، ونصف وقت الوفاة (الفترة الزمنية بالأيام المطلوبة للوصول إلى 50٪ من الوفيات) والحد الأقصى لعمر (الحد الأقصى للأيام اللازمة للوصول إلى 90٪ من الوفيات).
12. حساب الاختلافات في النسبة المئوية بين كل مجموعة علاج فيما يتعلق بمجموعة التحكم.
13. إجراء تحليل إحصائي لمقارنة مجموعات العلاج المختلفة.

Representative Results

الشكل 1: منحنيات العمر. على اليسار ، يتم الإبلاغ عن جدول تمثيلي تم فيه تسجيل عدد الذباب الميت كل 3 أيام ، سواء بالنسبة لمجموعة العلاج (متوسط + EDC [0.05 m M EE2]) أو لمجموعة التحكم (متوسط + مذيب) ، طوال الفترة التجريبية بأكملها. تم حساب متوسط عمر كل مجموعة باستخدام مجموع MATRIX. المنتج ; المجموعة المعالجة تقصير متوسط العمر مقارنة بمجموعة التحكم. على اليمين، يظهر منحنى البقاء على قيد الحياة نموذجية من الذباب الذكور تغذية المتوسطة التي تحتوي على EE2 (0.05 mM) أو الإيثانول فقط للسيطرة. انخفض منحنى النجاة بسرعة أكبر للذباب المعالج من مجموعة التحكم ، مع نقطة هبوط تحول سابقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
17α-Ethinylestradiol	Sigma	E4876-1G
Agar for Drosophila medium	BIOSIGMA	789148
Cornmeal	CA' BIANCA
Drosophila Vials	BIOSIGMA	789008	25 mm x 95 mm
Drosophila Vials	BIOSIGMA	789009	29 mm x 95 mm
Drosophila Vials	Kaltek	187	22 mm x 63 mm
Ethanol	FLUKA	2860
Glass Bottle			250 mL Bottles
Glass Vials	Microtech	ST 10024	Flat bottom tube 100 x 24
Instant Success yeast	ESKA		Powdered yeast
Methyl4-hydroxybenzoate	SIGMA	H5501
Stereomicroscope with LED lights	Leica		S4E
Sucrose	HIMEDIA	MB025
Hand blender Pimmy	Ariete		food processor