Denne protokol er et uddrag fra Bovier et al., Metoder til test af endokrine forstyrrelser i Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2019).
1. Tilberedning af fødevarer
- Til vedligeholdelse af bestanden og til larvevækst skal du bruge et majsmelsmedium, der indeholder 3% pulveriseret gær, 10% saccharose, 9% forkogt majsmel, 0,4% agar, derefter kaldet Cornmeal medium (CM).
- Sæt 30 g gær i 100 mL vand fra hanen, bring det i kog og lad det koge i 15 minutter.
- Separat blandes godt 90 g forkogt majsmel, 100 g sukker og 4 g agar i 900 mL vand fra hanen.
- Bring opløsningen i kog, sænk varmen og kog i 5 minutter under konstant omrøring.
- Efter 5 minutter tilsættes den varme gæropløsning og lad det simre i yderligere 15 minutter.
- Sluk for varmekilden, og lad opløsningen køle af til ca. 60 °C.
- Tilsæt 5 mL/L af 10% methyl 4-hydroxybenzoat i ethanol, bland grundigt og lad det sidde i 10 min.
BEMÆRK: Vær forsigtig med mængden af methyl 4-hydroxybenzoat, da en høj koncentration af fungicid kan være dødelig for larver.
- Mediet hældes i hætteglas/flasker: 8 mL i hvert flueglas (25 mm x 95 mm), 3 mL i hvert flueglas (22 mm x 63 mm) og 60 mL i hver flueflaske (250 mL).
- Dæk hætteglas med ostelærred og lad dem tørre ved stuetemperatur (RT) i 24 timer før opbevaring.
- Kalibrere eksperimentelt rigtige konsistens og hydrering af CM ved at ændre enten mængden af anvendt agar og / eller køling / tørring gange.
BEMÆRK: Hætteglas, indpakkede og indpakkede hætteglas er stabile i ca. 15 dage ved 4 °C.
- For Drosophila voksne, bruge et medium, der indeholder 10% pulveriseret gær, 10% saccharose, 2% agar, derefter kaldet voksen medium (AM).
- Der blandes 10 g pulveriseret gær, 10 g saccharose, 2 g agar i 100 mL destilleret vand.
- Bring denne blanding i kog to gange, med et 3 minutters interval, eller indtil agar er opløst, ved hjælp af en mikrobølgeovn.
- Når opløsningen er afkølet til 60 °C, tilsættes 5 ml/l methyl 4-hydroxybenzoat i ethanol, blandes grundigt og dispenseres i hætteglas (10 ml pr. hætteglas).
- Dæk hætteglas med cheesecloth og lad dem tørre ved RT i 24 timer før opbevaring.
BEMÆRK: Hætteglas, indpakkede og indpakkede hætteglas er stabile i ca. 15 dage ved 4 °C.
2. Drosophila EDC dosering
- Der fremstilles en passende stamopløsning, der opløser den valgte EDC i det passende opløsningsmiddel. For EE2 (molekylvægt 296,403) opløses 1,48 g i 10 ml 100% ethanol for at fremstille en 0,5 M lageropløsning og opbevares ved -80 °C.
ADVARSEL: EDC'er betragtes som miljøforurenende, og der bør træffes forholdsregler ved håndteringen af dem.
- EE2-stamopløsningen fortyndes i 10% ethanol i vand (v/v) for at opnå en 100 mM opløsning. Der foretages næste fortyndinger (0,1 mM, 0,5 mM og 1 mM) i CM-fødevarer, begyndende med den laveste koncentration og med den samme endelige koncentration af opløsningsmiddel for hver behandlingsgruppe. Til kontrolglassene anvendes samme volumen af opløsningsmidlet alene.
BEMÆRK: Det anbefales at holde opløsningsmidlets endelige koncentration så lav som muligt, idet der tages hensyn til, at den endelige koncentration af ethanol ikke må overstige 2 % i fluefoder.
- Opløsningen, der indeholder den rigtige fortynding af den valgte EDC, til den majsmelbaserede fødevare før størkning, blandes grundigt med en foodprocessor, dispenseres 10 ml i hætteglas, dækkes med bomuldsgas og tørres ved RT i 16 timer, før den tages i brug.
BEMÆRK: Brug dette medium umiddelbart efter forberedelsen.
- Til voksenopdræt fremstilles forskellige arbejdende EE2-opløsninger (henholdsvis 10 mM, 50 mM og 100 mM) i 10% ethanol i vand (v/v) og lag 100 μL af hver på am'ens overflade for at opnå den ønskede koncentration af EE2 (0,1 mM, 0,5 mM og 1 mM). Til kontrolbrugen anvendes samme volumen af opløsningsmidlet alene.
BEMÆRK: Alternativt tilsættes opløsningen, der indeholder den rigtige fortynding af den valgte EDC, til en lille mængde AM i et 50 ml konisk rør, vortex grundigt og stratificerer 1 ml af det på overfladen af AM-hætteglassene.
- Dæk hætteglas med bomuldsgas, lad tørring ved RT i 12-16 timer under blid omrøring og brug dem straks.
BEMÆRK: Tørringsprocessen bør justeres eksperimentelt, fordi det afhænger af den omgivende luftfugtighed.
3. Opdræt Fluer
- Brug en robust isogen stamme, såsom Oregon R, vedligeholdes af flere generationer i laboratoriet.
- Hold fluer i en befugtet, temperaturstyret inkubator med et naturligt lys på 12 timer: 12 timers mørk fotoperiode ved 25 °C i hætteglas, der indeholder CM-mad.
- I hver analyse skal du bruge hætteglas på RT.
4. Protokoller om levetid
- Der opsættes 20 fluer med 8 hunner og 4 hanner og huser ved 25 °C i CM (10 mL hver).
- Efter 4 dage kasseres fluer og læg hætteglas tilbage i inkubatoren.
BEMÆRK: Disse fluer kan bruges til at starte igen for at opnå andre alderssynkronerede kohorter af fluerne.
- I den sene eftermiddag på dagen 9 skal du fjerne alle nyligt frikloserede fluer fra hætteglassene og returnere hætteglas til inkubatoren.
BEMÆRK: et par voksne bør begynde at eclose så tidligt som den niende dag; kassation af disse fluer gør det muligt at samle et maksimalt antal synkroniserede fluer og undgå det skødesløse valg af tidligt emergent.
- 16-24 timer senere overføres de voksne fluer (1 dag gamle) af begge køn til fire grupper på 250 mL flasker, der indeholder AM-mad suppleret med tre forskellige EDC-koncentrationer og en med opløsningsmidlet alene. Hvis det er nødvendigt, indsamle en anden batch den næste dag.
- Hold fluer ved 25 °C i 2-3 dage for at give dem mulighed for at parre sig.
BEMÆRK: Dagen for overførsel til AM mad hætteglas svarer til den første dag i voksenalderen.
- Efter to-tre dage skal du sortere hver kohorte af fluer efter køn i to grupper under lys CO2-bedøvelse. Tilfældigt underopdeles hvert køn i fem hætteglas pr. behandling med en tæthed på 20 individer pr. hætteglas, indtil der er tre replikater af 5 parallelle hætteglas for hvert køn pr. behandling.
BEMÆRK: Arbejd med små grupper af fluer for at forhindre mulige langvarige sundhedsproblemer på grund af lang eksponeringstid for CO2.
- Forbered et levetidsregneark, hvor antallet af døde fluer trækkes fra antallet af overlevende fluer til den tidligere overførsel, på en sådan måde, at antallet af overlevende automatisk opnås ved hver overførsel.
- Overfør fluer til nye hætteglas, der indeholder den tilsvarende mad hver 3. dag på samme tid, og kontroller for døden.
BEMÆRK: Overførslen skal ske uden bedøvelse, der kan have en langsigtet negativ effekt på flyve levetid.
- Ved hver overførsel skal du registrere fluernes alder og antallet af døde fluer.
BEMÆRK: Antallet af overlevende fluer beregnes automatisk i regnearket, men det anbefales at kontrollere det visuelt. Fluer, der ved et uheld både undslipper eller dør under overførslen, bør ikke overvejes. Pas på ikke at tælle to gange døde fluer, der transporteres til det nye hætteglas, der rapporterer denne note i regnearket.
- Gentag trin 4.8 og 4.8.1, indtil alle fluer dør.
- For hver behandlingsgruppe skal du oprette en overlevelseskurve som vist i figur 1for at vise overlevelsessandsynligheden for en flue på et bestemt tidspunkt.
- Udfør tre uafhængige eksperimenter for hver behandlingsgruppe af fluer ved at bruge 100 nyligt ekskloserede fluer til hvert eksperiment.
- Forbered en tabel, hvor man kan rapportere den gennemsnitlige levetid (gennemsnitlige overlevelsesdage for alle fluer for hver gruppe), den halve dødstid (periode i dage, der kræves for at nå 50% dødelighed) og den maksimale levetid (maksimal mængde dage, der er nødvendige for at nå 90% dødelighed).
- Beregn forskellene i procent mellem hver behandlingsgruppe i forhold til kontrolgruppen.
- Udfør statistisk analyse for at sammenligne de forskellige behandlingsgrupper.
