ड्रोसोफिला मेलानोगेस्टरके लिए उम्र प्रोटोकॉल: फ्लाई दीर्घायु में मतभेदों की पहचान करने के लिए सर्वाइवल घटता पैदा करना

Overview

वैज्ञानिक ड्रोसोफिला उम्र प्रोटोकॉल का उपयोग यह मापने के लिए करते हैं कि विभिन्न प्रायोगिक स्थितियां मक्खियों की दीर्घायु को कैसे प्रभावित करती हैं और प्रायोगिक परिणामों की मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रक्रिया में अस्तित्व घटता उत्पन्न करते हैं । नमूना प्रोटोकॉल में एंडोक्राइन बाधित रसायनों, या ईडीसी, जैसे 17-α-एथिनिलेस्ट्रडिओल (ईई 2) की अलग-अलग सांद्रता के संपर्क में आने से दीर्घायु पर प्रभावों का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा रहा परख की सुविधा है।

Protocol

यह प्रोटोकॉल बोवियर एट अल से एक अंश है, ड्रोसोफिला मेलनोगेस्टर, जे विस एक्सप्रेस (2019) में एंडोक्राइन व्यवधान का परीक्षण करने के तरीके।

1. भोजन की तैयारी

1. स्टॉक रखरखाव के लिए और लार्वा विकास के लिए, 3% पाउडर खमीर, 10% सुक्रोज, 9% प्रीकुक्ड कॉर्नमील, 0.4% एगर, जिसे बाद में कॉर्नमील माध्यम (सीएम) कहा जाता है, युक्त कॉर्नमील माध्यम का उपयोग करें।
   1. 100 एमएल नल के पानी में खमीर के 30 ग्राम रखो, यह एक फोड़ा करने के लिए लाने के लिए और यह 15 मिनट के लिए फोड़ा।
   2. अलग से, 90 ग्राम प्रीकुक्ड कॉर्नमील, 100 ग्राम चीनी और 4 ग्राम एगर को 900 एमएल नल के पानी में मिलाएं।
   3. एक फोड़ा करने के लिए समाधान लाओ, गर्मी कम और 5 मिनट के लिए लगातार सरगर्मी पकाना ।
   4. 5 मिनट के बाद, गर्म खमीर समाधान जोड़ें और एक और 15 मिनट के लिए उबाल लें।
   5. गर्मी के स्रोत को बंद कर दें और समाधान को लगभग 60 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें।
   6. 10% मिथाइल 4-हाइड्रोक्सीबेनजोएट के 5 एमएल/एल को इथेनॉल में अच्छी तरह मिलाएं और इसे 10 मिनट तक बैठने दें।
      नोट: मिथाइल 4-हाइड्रोक्सीबेनजोएट की मात्रा से सावधान रहें, यह देखते हुए कि कवकनाशक की उच्च सांद्रता लार्वा के लिए घातक हो सकती है।
   7. माध्यम को शीशियों/बोतलों में बांटें: प्रत्येक फ्लाई शीशी (25 मिमी x 95 मिमी), प्रत्येक फ्लाई शीशी (22 मिमी x 63 मिमी) में 3 एमएल और प्रत्येक फ्लाई बोतल (250 एमएल) में 60 एमएल में 8 एमएल।
   8. चीज़क्लोथ के साथ शीशियों को कवर करें और उन्हें भंडारण से पहले 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर सूखने की अनुमति दें।
   9. या तो इस्तेमाल किया और/या ठंडा/सुखाने के समय की राशि को संशोधित करके सीएम के प्रायोगिक रूप से सही स्थिरता और जलयोजन को कैलिब्रेट करें ।
      नोट: अनप्लग्ड, बॉक्स्ड और लिपटे शीशियां 4 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 15 दिनों के लिए स्थिर हैं।
2. ड्रोसोफिला वयस्कों के लिए, 10% पाउडर खमीर, 10% सुक्रोज, 2% एगर, इसके बाद वयस्क माध्यम (एएम) नामक माध्यम का उपयोग करें।
   1. 10 ग्राम पाउडर खमीर, 10 ग्राम सुक्रोज, 2 ग्राम एगर को 100 मिली लीटर आसुत पानी में मिलाएं।
   2. इस मिश्रण को दो बार उबाल लें, 3 मिनट के अंतराल के साथ, या जब तक एगर भंग न हो जाए, माइक्रोवेव का उपयोग करके।
   3. एक बार जब समाधान 60 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा हो जाता है, तो इथेनॉल में 10% मिथाइल 4-हाइड्रोक्सीबेनजोएट के 5 एमएल/एल जोड़ें, अच्छी तरह से मिलाएं और शीशियों (10 एमएल प्रति शीशी) में बांट दें।
   4. चीज़क्लोथ के साथ शीशियों को कवर करें और भंडारण से पहले उन्हें 24 घंटे के लिए आरटी पर सूखने दें।
      नोट: अनप्लग्ड, बॉक्स्ड और लिपटे शीशियां 4 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 15 दिनों के लिए स्थिर हैं।

2. ड्रोसोफिला ईडीसी डोजिंग

1. उपयुक्त सॉल्वेंट में चयनित ईडीसी को भंग करने के लिए एक उपयुक्त स्टॉक समाधान तैयार करें। EE2 (आणविक वजन 296.403) के लिए, 0.5 मीटर स्टॉक समाधान बनाने और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए 100% इथेनॉल के 10 एमएल में 1.48 ग्राम भंग करें।
   सावधानी: ईडीसी को पर्यावरण प्रदूषक माना जाता है और उन्हें संभालने में सावधानियां बरती जानी चाहिए ।
2. 100 mm समाधान प्राप्त करने के लिए पानी में 10% इथेनॉल (v/v) में EE2 स्टॉक समाधान को पतला करें। सीएम फूड में अगला कमजोर (0.1 mm, 0.5 mm और 1 m) बनाएं, जो सबसे कम एकाग्रता के साथ शुरू होता है और प्रत्येक उपचार समूह के लिए सॉल्वेंट की समान अंतिम एकाग्रता का उपयोग करता है। नियंत्रण शीशियों के लिए अकेले सॉल्वेंट की एक ही मात्रा का उपयोग करें।
   नोट: सॉल्वेंट की अंतिम एकाग्रता को यथासंभव कम रखने की सिफारिश की जाती है, इस बात को ध्यान में रखते हुए कि इथेनॉल की अंतिम एकाग्रता फ्लाई फूड में 2% से अधिक नहीं होनी चाहिए।
3. ठोसकरण से पहले कॉर्नमील-आधारित भोजन में चयनित ईडीसी के सही कमजोर पड़ने वाले समाधान को जोड़ें, एक खाद्य प्रोसेसर के साथ अच्छी तरह से मिलाएं, 10 एमएल को शीशियों में बांटें, कपास की धुंध से ढक दें और उपयोग करने से पहले 16 घंटे के लिए आरटी पर सूख जाएं।
   नोट: इसकी तैयारी के तुरंत बाद इस माध्यम का उपयोग करें।
4. वयस्क पालन के लिए, ईई 2 (0.1 मीटर, 0.5 मीटर और 1 मीटर) की वांछित एकाग्रता प्राप्त करने के लिए, पानी में 10% इथेनॉल (v/v) और प्रत्येक की परत 100 माइक्रोन में क्रमशः विभिन्न कामकाजी EE2 समाधान (क्रमशः 10 mm, 50 mm और 100 mm) तैयार करें। नियंत्रण के लिए अकेले सॉल्वेंट की एक ही मात्रा का उपयोग करें।
   नोट: वैकल्पिक रूप से, चयनित ईडीसी के सही कमजोर पड़ने वाले समाधान को 50 एमएल शंकु नली में एएम की थोड़ी मात्रा में जोड़ें, भंवर अच्छी तरह से और एएम शीशियों की सतह पर इसके 1 एमएल को स्तरीकृत करें।
   1. कपास की धुंध के साथ शीशियों को कवर करें, कोमल आंदोलन के तहत 12-16 घंटे के लिए आरटी में सुखाने की अनुमति दें और उन्हें तुरंत उपयोग करें।
      नोट: सुखाने की प्रक्रिया को प्रायोगिक रूप से समायोजित किया जाना चाहिए क्योंकि परिवेश आर्द्रता पर निर्भर करता है।

3. मक्खियों का पालन

1. प्रयोगशाला में कई पीढ़ी द्वारा बनाए गए ओरेगन आर जैसे मजबूत आइसोजेनिक तनाव का उपयोग करें।
2. मक्खियों को एक आर्द्रीकृत, तापमान नियंत्रित इनक्यूबेटर में रखें, एक प्राकृतिक 12 घंटे प्रकाश के साथ: सीएम भोजन युक्त शीशियों में 25 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे डार्क फोटोपीरियोड।
3. प्रत्येक परख में, आरटी पर शीशियों का उपयोग करें।

4. उम्र प्रोटोकॉल

1. सीएम (10 एमएल प्रत्येक) में 25 डिग्री सेल्सियस पर 8 महिलाओं और 4 पुरुषों और घर के साथ मक्खियों की 20 शीशियों की स्थापना करें।
2. 4 दिनों के बाद मक्खियों को त्यागें और शीशियों को इनक्यूबेटर में वापस रखें।
   नोट: इन मक्खियों का उपयोग मक्खियों के अन्य उम्र-सिंक्रोनाइज्ड साथियों को प्राप्त करने के लिए फिर से शुरू करने के लिए किया जा सकता है।
3. दिन की देर दोपहर में 9, शीशियों से सभी नए eclosed मक्खियों को हटा दें और इनक्यूबेटर में शीशियों को वापस करें।
   नोट: कुछ वयस्कों को नौवें दिन के रूप में जल्दी से बंद करना शुरू कर देना चाहिए; इन मक्खियों को त्यागने से प्रारंभिक आकस्मिक के लापरवाह चयन से बचने के लिए, सिंक्रोनाइज्ड मक्खियों की अधिकतम संख्या एकत्र करने की अनुमति देता है।
4. 16-24 घंटे बाद, दोनों लिंगों के वयस्क मक्खियों (1 दिन पुराने) को 250 एमएल बोतलों के चार समूहों में स्थानांतरित करें जिसमें एएम भोजन तीन अलग-अलग ईडीसी सांद्रता के साथ पूरक है और एक अकेले सॉल्वेंट के साथ। यदि आवश्यक हो, तो अगले दिन एक और बैच इकट्ठा करें।
5. मक्खियों को 2-3 दिनों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें ताकि उन्हें साथी की अनुमति मिल सके।
   नोट: एएम खाद्य शीशियों में स्थानांतरण का दिन वयस्कता के पहले दिन से मेल खाता है।
6. दो-तीन दिनों के बाद, हल्के सीओ₂ एनेस्थेटाइजेशन के तहत दो समूहों में सेक्स द्वारा मक्खियों की प्रत्येक पलटन को सॉर्ट करें। बेतरतीब ढंग से प्रति शीशी 20 व्यक्तियों के घनत्व पर उपचार के प्रति पांच शीशियों में प्रत्येक सेक्स उपविभाजन, जब तक वहां प्रत्येक उपचार के प्रति प्रत्येक लिंग के लिए 5 समानांतर शीशियों के तीन प्रतिकृति हैं ।
   नोट: सीओ 2 के लिए लंबे समय तक जोखिम समय के कारण संभावित_लंबेसमय तक चलने वाले स्वास्थ्य मुद्दों को रोकने के लिए मक्खियों के छोटे समूहों के साथ काम करें ।
7. एक उम्र स्प्रेडशीट तैयार करें जिसमें मृत मक्खियों की संख्या जीवित मक्खियों की संख्या से पिछले हस्तांतरण तक घटाया जाता है, इस तरह से स्वचालित रूप से प्रत्येक हस्तांतरण पर जीवित बचे लोगों की संख्या प्राप्त करने के लिए।
8. एक ही समय में हर 3 दिनों में संबंधित भोजन युक्त नई शीशियों में स्थानांतरित करें और मृत्यु की जांच करें।
   नोट: स्थानांतरण संज्ञाहरण के बिना जगह ले जाना चाहिए कि मक्खी दीर्घायु पर एक दीर्घकालिक नकारात्मक प्रभाव हो सकता है ।
   1. प्रत्येक हस्तांतरण पर, मक्खियों की उम्र और मृत मक्खियों की संख्या रिकॉर्ड करें।
      नोट: जीवित मक्खियों की संख्या स्वचालित रूप से स्प्रेडशीट में गणना की जाती है लेकिन इसे नेत्रहीन रूप से जांचने की सिफारिश की जाती है। स्थानांतरण के दौरान गलती से बचने या मरने वाले मक्खियों पर विचार नहीं किया जाना चाहिए। स्प्रेडशीट में इस नोट की रिपोर्टिंग करने वाली नई शीशी के लिए किए गए दो बार मृत मक्खियों की गिनती न करें।
   2. सभी मक्खियों के मरने तक चरण 4.8 और 4.8.1 दोहराएं।
9. प्रत्येक उपचार समूह के लिए, किसी भी विशेष समय पर फ्लाई की जीवित रहने की संभावना को प्रदर्शित करने के लिए, चित्र 1में दिखाए गए एक अस्तित्व वक्र बनाएं।
10. प्रत्येक प्रयोग के लिए 100 नए eclosed मक्खियों का उपयोग करके, मक्खियों के प्रत्येक उपचार समूह के लिए तीन स्वतंत्र प्रयोग करें।
11. एक तालिका तैयार करें जिसमें औसत उम्र (प्रत्येक समूह के लिए सभी मक्खियों के मतलब जीवित रहने के दिन) की रिपोर्ट करने के लिए, आधी मृत्यु का समय (50% मृत्यु दर तक पहुंचने के लिए आवश्यक दिनों में समय की अवधि) और अधिकतम उम्र (90% मृत्यु तक पहुंचने के लिए आवश्यक दिनों की अधिकतम मात्रा)।
12. नियंत्रण समूह के संबंध में प्रत्येक उपचार समूह के बीच प्रतिशत में अंतर की गणना करें।
13. विभिन्न उपचार समूहों की तुलना करने के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण करें।

Representative Results

चित्रा 1: उम्र घटता है। बाईं ओर, एक प्रतिनिधि तालिका की सूचना दी जाती है जिसमें मृत मक्खियों की संख्या हर 3 दिनों में दर्ज की गई है, दोनों उपचार समूह (मध्यम + EDC [0.05 mM EE2]) के लिए और नियंत्रण समूह (मध्यम + विलायक) के लिए, पूरे प्रायोगिक अवधि में। प्रत्येक समूह की औसत उम्र मैट्रिक्स योग का उपयोग करके गणना की गई है। उत्पाद; इलाज समूह नियंत्रण समूह की तुलना में मतलब उम्र को छोटा । दाईं ओर, एक विशिष्ट अस्तित्व वक्र पुरुष मक्खियों को माध्यम युक्त EE2 (0.05 m M) या नियंत्रण के लिए केवल इथेनॉल के साथ खिलाया जाता है। बचे हुए वक्र नियंत्रण समूह की तुलना में इलाज मक्खियों के लिए अधिक तेजी से कम हो गया, एक पहले मोड़ ड्रॉप प्वाइंट के साथ । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
17α-Ethinylestradiol	Sigma	E4876-1G
Agar for Drosophila medium	BIOSIGMA	789148
Cornmeal	CA' BIANCA
Drosophila Vials	BIOSIGMA	789008	25 mm x 95 mm
Drosophila Vials	BIOSIGMA	789009	29 mm x 95 mm
Drosophila Vials	Kaltek	187	22 mm x 63 mm
Ethanol	FLUKA	2860
Glass Bottle			250 mL Bottles
Glass Vials	Microtech	ST 10024	Flat bottom tube 100 x 24
Instant Success yeast	ESKA		Powdered yeast
Methyl4-hydroxybenzoate	SIGMA	H5501
Stereomicroscope with LED lights	Leica		S4E
Sucrose	HIMEDIA	MB025
Hand blender Pimmy	Ariete		food processor