Протокол продолжительности жизни для Drosophila меланогастер: Создание кривых выживания для выявления различий в лету долголетия

Overview

Ученые используют протокол продолжительности жизни Дрозофилы для измерения того, как различные экспериментальные условия влияют на продолжительность жизни мух и генерируют кривые выживания в процессе количественной оценки экспериментальных результатов. Протокол выборки содержит анализ, применяемый для изучения воздействия на продолжительность жизни от воздействия различных концентраций эндокринных химических веществ-разрушителей, или ЭЦП, таких как 17-α-этинилэстрадиол (EE2).

Protocol

Этот протокол является выдержкой из Bovier и др., Методы для тестирования эндокринных нарушений в Drosophila меланогастер, J. Vis. Exp. (2019).

1. Приготовление пищи

1. Для поддержания запасов и для роста личинок используйте среду кукурузной муки, содержащую 3% порошкообразных дрожжей, 10% сахарозы, 9% приготовленной кукурузной муки, 0,4% агара, после чего называемого Cornmeal medium (CM).
   1. Положите 30 г дрожжей в 100 мл водопроводной воды, довлейте до кипения и дайте ему закипеть в течение 15 мин.
   2. Отдельно хорошо перемешайте 90 г предварительно приготовленной кукурузной муки, 100 г сахара и 4 г агара в 900 мл водопроводной воды.
   3. Довести раствор до кипения, снизить огонь и варить в течение 5 минут непрерывно помешивая.
   4. Через 5 минут добавьте раствор горячих дрожжей и тушите еще 15 минут.
   5. Выключите источник тепла и дайте раствору остыть до 60 градусов цельсия.
   6. Добавьте 5 мл/л 10% метил 4-гидроксибензоата в этанол, тщательно перемешайте и дайте ему посидеть 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны с количеством метил 4-гидроксибензоата, учитывая, что высокая концентрация фунгицида может быть смертельным для личинок.
   7. Разпределите среду во флаконы/бутылки: 8 мл в каждый флакон мухи (25 мм х 95 мм), 3 мл в каждый флакон мухи (22 мм х 63 мм) и 60 мл в каждую бутылку мухи (250 мл).
   8. Обложка флаконы с марлей и дайте им высохнуть при комнатной температуре (RT) в течение 24 ч до хранения.
   9. Калибровка экспериментально правой консистенции и гидратации CM путем изменения либо количество агара используется и / или охлаждения / сушки раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: отключенные, коробочки и завернутые флаконы стабильны в течение примерно 15 дней при 4 градусах Цельсия.
2. Для взрослых Drosophila, использовать среды, содержащие 10% порошкообразных дрожжей, 10% сахарозы, 2% агара, после этого называется взрослых среды (AM).
   1. Смешайте 10 г порошкообразных дрожжей, 10 г сахарозы, 2 г агара в 100 мл дистиллированной воды.
   2. Доведите эту смесь до кипения два раза, с интервалом в 3 минуты, или до тех пор, пока агар не растворяется, с помощью микроволновой печи.
   3. После того, как раствор остынет до 60 градусов по Цельсию, добавьте 5 мл/л 10% метил 4-гидроксибензоата в этаноле, тщательно перемешайте и размешайте во флаконах (10 мл на флакон).
   4. Обложка флаконы с марлей и дайте им высохнуть на RT в течение 24 ч перед хранением.
      ПРИМЕЧАНИЕ: отключенные, коробочки и завернутые флаконы стабильны в течение примерно 15 дней при 4 градусах Цельсия.

2. Дрозофила EDC Досинг

1. Подготовье соответствующего биржевого раствора, растворяющий выбранный EDC в подходящем растворители. Для EE2 (молекулярный вес 296.403), растворить 1,48 г в 10 мл 100% этанола, чтобы сделать 0,5 М фондовый раствор и хранить при -80 градусов по Цельсию.
   ВНИМАНИЕ: ЭДК считаются загрязнителями окружающей среды, и при их обращении следует принимать меры предосторожности.
2. Разбавить раствор бульона EE2 в 10% этанола в воде (v/v) для получения раствора 100 мМ. Сделайте следующее разбавление (0,1 мМ, 0,5 ммм и 1 мм) в пище СМ, начиная с самой низкой концентрации и используя ту же окончательную концентрацию растворителя для каждой группы лечения. Для контрольных флаконов используйте один и тот же объем растворителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: рекомендуется держать окончательную концентрацию растворителя как можно ниже, имея в виду, что окончательная концентрация этанола не должна превышать 2% в лету пищи.
3. Добавьте раствор, содержащий правильное разбавление выбранного EDC, в продукты на основе кукурузной муки перед затвердеванием, тщательно перемешайте с кухонным комбайном, раздайте 10 мл во флаконы, накройте хлопчатобумажной марлей и дайте высохнуть в RT в течение 16 ч перед использованием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: использовать эту среду сразу после его подготовки.
4. Для взрослого воспитания подготовьтесь к различным рабочим растворам EE2 (10 мм, 50 мм и 100 мм соответственно) в 10% этанола в воде (v/v) и слое 100 л каждого на поверхности АМ, чтобы получить желаемую концентрацию ЭЭ2 (0,1 мМ, 0,5 мм и 1 мМ). Для контроля использовать тот же объем растворителя в одиночку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: в качестве альтернативы добавьте раствор, содержащий правильное разбавление выбранного EDC, к небольшому количеству АМ в конической трубке 50 мл, тщательно вихрем и расслоение 1 мл его на поверхность флаконов AM.
   1. Обложка флаконы с хлопчатобумажной марлей, позволяют сушки на RT в течение 12-16 ч под нежным волнением и использовать их немедленно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: процесс сушки следует регулировать экспериментально, поскольку он зависит от влажности окружающей среды.

3. Воспитание мух

1. Используйте надежный изогенный штамм, такой как Oregon R, поддерживаемый несколькими поколениями в лаборатории.
2. Храните мух в увлажненные, контролируемые температурой инкубатор, с естественным 12 ч света: 12 ч темной фотопериод при температуре 25 градусов по Цельсию во флаконах, содержащих CM пищи.
3. В каждом анализе используйте флаконы на RT.

4. Протокол продолжительности жизни

1. Установите 20 флаконов мух с 8 самок и 4 самцов и дом на 25 градусов по Цельсию в CM (10 мл каждый).
2. Через 4 дня отбросить мух и поместить флаконы обратно в инкубатор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: эти мухи могут быть использованы, чтобы начать снова, чтобы получить другие возрастные синхронизированные когорты мух.
3. Во второй половине дня 9, удалить все вновь исключены мухи из флаконов и вернуть флаконы в инкубатор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: несколько взрослых должны начать eclose уже на девятый день; Отбрасывание этих мух позволяет собрать максимальное количество синхронизированных мух, избегая неосторожного отбора ранних возникающих.
4. 16-24 ч позже, передача взрослых мух (1 день) обоих полов в четыре группы по 250 мл бутылки, содержащие AM питание дополняется тремя различными концентрациями EDC и один с растворителем в одиночку. При необходимости соберите еще одну партию на следующий день.
5. Поддерживайте мух при 25 градусов по Цельсию в течение 2-3 дней, чтобы позволить им спариваться.
   ПРИМЕЧАНИЕ: день перехода на АМ пищевые флаконы соответствует первому дню взрослой жизни.
6. После двух-трех дней, сортировать каждую когорту мух по полу в две группы под светом CO₂ анестезии. Случайно подраздеть каждый пол на пять флаконов на лечение при плотности 20 особей на флакон, пока Есть три репликации 5 параллельных флаконов для каждого пола на каждое лечение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Работа с небольшими группами мух, чтобы предотвратить возможные долгосрочные проблемы со здоровьем из-за длительного времени воздействия CO₂.
7. Подготовь таблицу продолжительности жизни, в которой количество мертвых мух вычитается из числа выживших мух на предыдущую передачу, таким образом, чтобы автоматически получить количество выживших при каждой передаче.
8. Передача летит в новые флаконы, содержащие соответствующую пищу каждые 3 дня в то же время и проверить на смерть.
   ПРИМЕЧАНИЕ: передача должна происходить без анестезии, которая может иметь долгосрочное негативное влияние на продолжительность полета.
   1. При каждой передаче записывают возраст мух и количество мертвых мух.
      ПРИМЕЧАНИЕ: количество выживших мух автоматически рассчитывается в электронной таблице, но рекомендуется проверить его визуально. Мухи, которые случайно как бежать или умереть во время передачи не должны рассматриваться. Будьте осторожны, чтобы не считать дважды мертвых мух, перенесенных на новый флакон отчетности эту записку в таблице.
   2. Повторите шаги 4.8 и 4.8.1 до тех пор, пока все мухи не погибнут.
9. Для каждой группы лечения, создать кривую выживания, как показано на рисунке 1, для того, чтобы показать вероятность выживания мухи в любое конкретное время.
10. Выполните три независимых эксперимента для каждой группы лечения мух, используя 100 новых исключенных мух для каждого эксперимента.
11. Подготовьтесь к таблице, в которой будут представлены средняя продолжительность жизни (средние дни выживания всех мух для каждой группы), половина времени смерти (период времени в днях, необходимых для достижения 50% смертности) и максимальная продолжительность жизни (максимальное количество дней, необходимых для достижения 90% смертности).
12. Рассчитайте различия в процентах между каждой группой лечения по отношению к контрольной группе.
13. Выполните статистический анализ для сравнения различных групп лечения.

Representative Results

Рисунок 1: Кривые продолжительности жизни. Слева сообщается репрезентативная таблица, в которой число мертвых мух регистрируется каждые 3 дня, как для группы лечения (средний EDC (0,05 мММ ЭЭ2), так и для контрольной группы (средний растворитель) на протяжении всего экспериментального периода. Средний срок службы каждой группы был рассчитан с помощью MATRIX SUM. ПРОДУКТ; обработанная группа сократила средний срок службы по сравнению с контрольной группой. Справа показана типичная кривая выживания самцов мух, питаемых средой, содержащей EE2 (0,05 мМ) или только этанола для управления. Кривая выжившего снижалась быстрее для обработанных мух, чем для контрольной группы, с более ранней поворотной точкой падения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
17α-Ethinylestradiol	Sigma	E4876-1G
Agar for Drosophila medium	BIOSIGMA	789148
Cornmeal	CA' BIANCA
Drosophila Vials	BIOSIGMA	789008	25 mm x 95 mm
Drosophila Vials	BIOSIGMA	789009	29 mm x 95 mm
Drosophila Vials	Kaltek	187	22 mm x 63 mm
Ethanol	FLUKA	2860
Glass Bottle			250 mL Bottles
Glass Vials	Microtech	ST 10024	Flat bottom tube 100 x 24
Instant Success yeast	ESKA		Powdered yeast
Methyl4-hydroxybenzoate	SIGMA	H5501
Stereomicroscope with LED lights	Leica		S4E
Sucrose	HIMEDIA	MB025
Hand blender Pimmy	Ariete		food processor