Denne protokollen er et utdrag fra Castells-Nobau et al., Two Algorithms for High-throughput og Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology, J. Vis. Exp. (2017).
1. Krav før bildebehandling
- Utfør Drosophila åpne bokpreparater av tredje instar vandrende larver (L3), som tidligere beskrevet.
- Co-immunolabel Drosophila NMJ terminaler ved hjelp av en kombinasjon av to markører: Dlg-1 eller Hrp sammen med Brp for analyse med "Drosophila NMJ Morphometrics", og Syt eller Csp sammen med Brp for analyse med"Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
MERK: Antistoffer fra samme art kan kombineres ved å forhåndsmerke en med et antistoff-konjugeringssett som Zenon Alexa-merkingssettene.
- Bilde NMJ terminaler ved hjelp av et mikroskop av valg, for eksempel fluorescens (med eller uten ApoTome) eller konfokal mikroskopi.
- Skaff deg en 2-kanals bildestakk av NMJ-terminalen.
- Juster mikroskopinnstillingene på en måte som kanal 1 innhenter NMJ-terminalen immunmerket med Dlg-1 (eller Hrp, Syt, Csp) og kanal 2 NMJ-terminalen immunmerket med Brp.
- Du kan eventuelt analysere enkanalsbilder (av synapser immunmerket med et enkelt antistoff) med makroene. Image NMJs immunolabeled unikt med Dlg-1 eller Hrp for analyse med"Drosophila NMJ Morphometrics", eller Syt eller Csp for"Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
MERK: Det er ikke mulig å analysere synapser immunostert med bare anti-Brp.
- Eksporter de oppnådde bildene som individuelle .tiff filer. Inverter kanalrekkefølgen før du kjører makroene, hvis de ikke anskaffes som angitt.
2. Programvarekrav og installasjon
- Last ned makroene:"Drosophila NMJ Morphometrics" og"Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" fra følgende nettsted: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399.v1.
- Flytt markøren til mappen "Macros update 1", og klikk på det vises alternativet "view". Det vises en liste med innholdet i denne mappen. Mappen inneholder makroene "Drosophila NMJ Morphometrics" og"Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
MERK: Begge makroene er kompatible med Fiji versjon 1.4, som også finnes i samme mappe. Makroene kjører kanskje ikke på nyere versjoner. Bruk den medfølgende versjonen 1.4. Det er uproblematisk å starte denne versjonen, selv på datamaskiner med en nyere Fiji-versjon tilgjengelig.
- Klikk på "Last ned alle". Mappeinnholdet lastes ned til datamaskinen som en .zip fil. Pakk ut den nedlastede filen.
- Kopier filene Drosophila_NMJ_Morphometrics.ijm og Drosophila_NMJ_Bouton Morphometrics.ijm til Fiji.app/plugins/ katalog. Når du starter programmet på nytt, vises makroene nederst på rullegardinmenyen Plugins.
3. Kjør submakroen "Konverter til stakk" for å lage Z-projeksjoner og hyperstakker av NMJ-bildene
- Start det grafiske grensesnittet ved å velge Plugins på verktøylinjen og velg"Drosophila NMJ Morphometrics" i rullegardinmenyen.
- Definer innstillingen Unik filstreng i makroens grafiske grensesnitt.
MERK: Mikroskopprogramvaren bruker en identifikasjonssignatur til å organisere plan og kanaler når du lagrer stabler som individuelle ".tiff filer. Den angitte unike filstrenginnstillingen må angi signaturen som er tilordnet av programvaren til det første planet i den første kanalen (viktig: laveste plan og kanalnummer må angis).
- Velg bare undermakroen "Konverter til stabel" og klikk "ok" og velg mappen der bildene ligger. Hvis en hovedkatalog med flere undermapper er valgt, behandles alle individuelle .tiff filer i hovedkatalogen og undermappen som samsvarer med de unike filstrengvilkårene.
- Hvis z-stakken bare inneholder én kanal, velger du boksen "Bare kanal 1".
- Legg merke til at to nye filer per NMJ-bilde, som standard kalt stack_image_name og flatstack_image_name, vises. Oppbevar bare disse stakkene og flatstakken for videre analyse. Den .tiff filserien kan slettes på dette tidspunktet, minimere den nødvendige lagringskapasiteten og unngå potensielle feilkilder.
4. Kjør undermakroen "Definere avkastning" for å avgrense NMJ-interesseterminalen
- Start det grafiske grensesnittet til"Drosophila NMJ Morphometrics".
- Merk bare av i avmerkingsboksen "Definer avkastning" og trykk "OK" og velg hovedkatalogen der bildene som er berettiget flatstack_name lagres, og trykk på "Velg". Undermakroen Definer avkastning søker automatisk gjennom alle undermapper i den valgte hovedkatalogen.
- Når den første projeksjonen åpnes, velger du verktøyet "Frihåndsvalg" på verktøylinjen.
- Ved hjelp av musen tegne et utvalg som utelukkende inneholder hele NMJ terminal av interesse og klikk "OK" i vinduet "Definer terminal". Makroen fortsetter med neste projeksjon.
- Avgrens neste avkastning og gjenta til alle ROIer er definert. ROI-bildefilen, kalt "roi_image_name", vil bli lagret i samme katalog som de tidligere genererte stakk- og projeksjonsbildene for hver av de behandlede bildene. Utdataene for denne undermakroen er et binært bilde av avkastningen i hvitt på svart bakgrunn.
5. Kjør submakroen "Analyser" for å kvantifisere NMJ-terminalfunksjoner
- Gå til verktøylinjen, velg "Plugins" og bruk:
"Drosophila_NMJ_Morphometrics" ved analyse av synapser immunmerket med anti-Dlg-1 eller anti-Hrp (kanal 1) sammen med anti-Brp (kanal 2), eller "Drosophila_NMJ_Bouton_Morphometrics" når du analyserer synapser immunmerket med anti-Syt eller anti-Csp (kanal 1) sammen med Brp (kanal 2).
- Når en kanals bildestakker skal analyseres (strukturkanalen Dlg-1 eller HRP for "Drosophila_NMJ_Morphometrics", eller Syt eller Csp for"Drosophila_NMJ__Bouton_Morphometrics"), merker du av for "Bare kanal 1".
- Juster skalaen som tilsvarer bildene som skal analyseres.
- Hvis én piksel i bildet tilsvarer 2,5 μm, angir du Skala-piksler = 1, Skaleringsavstand i μm = 2,5. I tilfelle begge innstillingene er igjen ved 0, vil NMJ-området, omkretsen, lengden og lengste grenlengde uttrykkes i antall piksler.
- Juster om nødvendig standard analyseinnstillinger for makroen. Utfør justeringer bare hvis undermakroen "Analyser" tidligere har blitt kjørt med utilfredsstillende resultater (se slutten av denne delen, og avsnitt 6 for instruksjoner om hvordan du optimaliserer innstillingene).
- Merk av i avmerkingsboksene "Analyser" og "Vent" og trykk "OK".
- Merk av for "Vent" når du kjører undermakroen "Analyser" på 2-kanals bilder. Ellers kan feil i aktiv sonetelling oppstå på grunn av begrenset datamaskinkapasitet.
- Når et nytt vindu "Velg en katalog" åpnes, velger du katalogen der bildene er plassert og trykker på "velg". Makroen analyserer alle bilder som er lagret i hovedkatalogen, og eventuelt etterfølgende mapper (ved hjelp av de tre filene fra å utføre de forrige delmakroene: stack_image_name, flatstack_image_name og roi_image_name). Makroen behandler hvert bilde enkeltvis og etter hverandre. Dette kan ta flere minutter per bildestakk (avhengig av datamaskinens kapasitet).
- Når du har kjørt makroen, må du være oppmerksom på at en ny bildefil med navnet res_image_name for hver analyserte synapse som er lagret, opprettes i den overordnede mappen. De kvantitative målingene vil bli lagret som "resultat.txt" fil.
- Undersøk alle resultatbilder for å oppdage og ekskludere bilder med segmenteringsfeil. Mulige segmenteringsfeil er beskrevet i tabell 1, sammen med råd om hvordan du justerer innstillinger for å omgå disse feilene. Resultatbilder med slike segmenteringsfeil finnes som eksempler i figur 1.
MERK: Når du kjører makroen med standardinnstillingene som ble observert i brukergrensesnittet, var det en nøyaktighet på omtrent 95 % når makrovurderingen ble sammenlignet med manuell evaluering.
6. Juster makroinnstillingene til bildene
- Når mer enn 5 % av bildene viser segmenteringsfeil, kan du utforske de forskjellige algoritmene for å definere/velge de mest passende makroinnstillingene for bildene.
- Juster radiusverdi for rullende ball
MERK: Funksjonen for rullende kuleradius trekker fra bakgrunnen i bildet. Denne funksjonen er av avgjørende betydning når du arbeider med bilder som er anskaffet på fluorescensmikroskoper og/eller når bilder har høy bakgrunnsstøy. Subtraksjonen av bakgrunnen vil hjelpe makroens autoterskeltrinn til å produsere tilstrekkelig segmentering av NMJ-terminalene.
- Velg tre NMJ-stack_image_name bilder generert av undermakroen Konverter til stakk. Velg bilder som er representative for bildedatasettet.
- Velg Bilde på verktøylinjen, | Farge | Delte kanaler. To bildestakker opprettes, en som representerer henholdsvis kanal 1 og den andre kanal 2, og lagrer dem.
- Åpne bildestakken som tilhører kanal 1 åpen, tilsvarende Dlg-1, Hrp, Syt eller Csp immunolabeling.
- Kjør filteret "Trekk fra bakgrunn" ved å velge "Prosess" på verktøylinjen etterfulgt av "Trekk fra bakgrunn ..." i rullegardinmenyen.
- Klikk på forhåndsvisningsboksen i popup-vinduet og juster rullende kuleradius til verdien som passer best for bildene. Innstillingen "Rullende kuleradius" bør justeres til verdier som øker kontrasten mellom synapse og bakgrunn (se figur 2A').
- Se figur 2 for et eksempel. I panel A viser deler av synapsen de samme grå nivåene som bakgrunnen, mens i figur 2-panelet A' resulterer en "Rullende kuleradius" på 500 i sterk kontrast mellom synapsen og bakgrunnen.
- Opprette en z-projeksjon ved å velge bilde | på verktøylinjen Stable| Z-projeksjon, velg Projeksjonstype = Maksimal intensitet og lagre det resulterende bildet. Når den riktige verdien for rullende kuleradius er definert, kjører du algoritmen "Trekk fra bakgrunn" på de gjenværende representative bildene med samme rullende kuleradiusverdi. Opprett Z-projeksjonene og lagre dem (i en hvilken som helst katalog).
MERK: Radiusverdien for rullende ball for 8-biters eller RGB-bilder må være minst like stor som radiusen til det største objektet i bildet som ikke er en del av bakgrunnen. For 16-biters og 32-biters bilder bør radiusen være omvendt proporsjonal med bildepunktverdiområdet.
- Bestemme de ulike automatiske terskler som skal brukes
- Åpne Z-projeksjonene som er lagret i forrige trinn (6.2.6) og Velg bilde-| Juster | Automatisk | Prøv alle.
- Som et binært terskelresultatbilde vises med alle forskjellige algoritmer for automatisk terskelverdi, må du bestemme den mest passende algoritmen for bildene.
- Når du kjører makroen senere, endrer du terskelen i makroinnstillingene tilsvarende.
- Bruk mer restriktive terskler som "RenyiEntrophy" eller "Moments" som NMJ disposisjonsterskel og mer tillatte terskler som "Li" for å bestemme NMJ skjelettet, og "Huang" for å bestemme aktive soner. Når bildene er veldig skarpe med liten eller ingen bakgrunn, bruk "Huang" som" NMJ disposisjonsterskel. Ellers kan deler av synapsen mangle etter bildesegmentering.
- Se figur 2B for et eksempel. Passende segmentering av synapsen oppnås med automatiske terskler uthevet av grønne bokser. Noen eksempler på ikke-egnede terskler er uthevet av røde bokser (merk av for synapser ved høy forstørrelse). I sistnevnte mangler begge deler av synapsen eller deler av bakgrunnen er inkludert.
- Bestem maksimal størrelse på de små partiklene
MERK: Denne funksjonen vil utelukke alle partikler som oppdages av NMJ-omrissterskelen og skjelettterskelen som er mindre enn den definerte verdien i innstillingen "små partikler" fra analysen. Denne verdien defineres i piksler. Denne funksjonen fungerer som et støyfilter og er veldig nyttig når høye hastigheter på ikke-jevn bakgrunn (for eksempel krystaller / støv) er til stede i de oppnådde bildene.
- Åpne Z-projeksjonene som ble lagret i trinn 6.2.6. og angi skalaen for å oppdage antall piksler via Analyser | Angi skala. Bruk følgende innstillinger: avstand i piksler = 1, kjent avstand = 1, bildepunktproporsjoner = 1, Lengdeenhet = piksel og trykk "Ok". Klikk på "Ellipsevalg" -verktøyet på verktøylinjen.
- Ved hjelp av musen tegne et utvalg tett rundt enkeltpartikler som er tilstede i immunostaining, men ikke tilhører NMJ. Trykk CTRL+M for å få en Windows-bruker eller cmd+m for Mac-brukere. Et resultatvindu åpnes, noe som angir området til partiklene som er valgt i antall piksler.
- Gjenta det forrige trinnet flere ganger med flere artefakter til stede på bildene for å bestemme det største forurensende partikkel-/artefaktområdet. Dette vil være verdien som skal angis i innstillingen når makroen kjøres senere. Når du kjører makroen, sett "Small Particles Size" som den minste observerte partikkelstørrelsen pus en margin på 25%.
- Se figur 2D for eksempel. Den største krystallen som oppdages har et areal på 112 piksler. Innstillingen "Liten partikkelstørrelse" , når du behandler dette bildet med makroen, bør settes til 125 - 150.
- Bestem minimum boutonstørrelse
MERK: Denne funksjonen vil ekskludere alle kamper som oppdages av NMJ-disposisjonsterskelen som er mindre enn den definerte verdien fra analysen. Denne verdien defineres i piksler.
- Følg de samme trinnene som beskrevet i avsnitt 6.4, men tegn i dette tilfellet et utvalg rundt de minste kampene som er til stede i NMJ-terminalen. Velg det minste området som tilsvarer den minste boutonen av de målte. Dette er verdien som skal angis i minimumsinnstillingen for boutonstørrelse når du kjører makroen senere.
- Definere verdien for Maksimal støytoleranse
- Hvis du vil definere verdien "Finn maksimal støytoleranse" for makroen, åpner du kanal 2 Z-stakken som er lagret i avsnitt 6.2.2.
- Gå til plugins-fanen i popup-menyen, velg Behandle | Maksimum(3D), og når maximum_image_name vises (som kan ta noen minutter), lukker du den opprinnelige bildestakken.
- Velg Maximum..._image_name (den nylig oppnådde bildestakken) og velg Plugins | Behandle | Minimum (3D), når det nye bildet Minimum av Maximum..._image_name apears lukke maksimum ... _image_name stakk.
- Velg Behandle | på verktøylinjen. Finn maxima.... Et nytt vindu "Finn maxima..." åpnes. Klikk avkrysningsruten "Valg av forhåndsvisningspunkt..." og fyll ut "Støytoleranse"-boksen med standard makroinnstilling 50. Maxima-punktene vil bli angitt i bildet som små kryss.
- Øk verdien "Støytoleranse" hvis du observerer et overskudd av kommenterte aktive soner, det vil si kryss som ikke er på toppen av aktive soner som ikke er i fokus på det valgte stakkplanet, eller falske aktive soner som oppdages i bakgrunnen.
- På den annen side, hvis du observerer ufullstendig kommenterte aktive soner, det vil si aktive soner i fokus som ikke gjenkjennes, reduserer du verdien "Maxima støytoleranse". Fortsett å prøve forskjellige verdier etter denne prosedyren til kryssene merker aktive soner i fokus på riktig måte. Fyll "Finn maksimal støytoleranse" med denne verdien.
- Se figur 2C for et eksempel. Det oppdages for mange aktive soner. I figur 2C oppdages bare de aktive sonene i fokus når du øker verdien "Maxima støytoleranse".
- Kjør undermakroen Analyser for de representative bildene som ble valgt i trinn 5.1, med innstillingene definert i alle de forrige trinnene.
- Juster nedre og øvre terskel for Brp-puncta
- Legg merke til at en ny fil vises etter at du har kjørt makroen i henhold til trinn 6.6, kalt 2_active_zone_stack_image_name. I denne bildestakken er de aktive sonene som oppdages av funksjonen "Finn maxima", indikert med hvite prikker i hvert plan.
- Åpne denne filen ved å dra og slippe den på verktøylinjen og velge Bilde | Stable | Z-prosjekt | Projeksjonstype = Sum-stykker. En projeksjon av 2_active_zone_stack_image_name vil bli oppnådd.
- Velg bilde | Juster | Terskelen. Et nytt vindu "Terskel" åpnes. Skyv den øvre linjen for å velge en terskelverdi der alle ønskede foci/Brp-positive flekker visualiseres i rødt.
MERK: Hvis terskelen er satt for lavt, telles et overskudd av aktive soner. Hvis satt for høyt, vil en brøkdel av de aktive sonene bli savnet.
- Se figur 2E for eksempel. Når terskelverdien er satt til 400, inkluderes ikke de fleste aktive sonene (symbolisert som en foci på 1 bildepunkt) i segmenteringen, siden de ikke er uthevet i rødt (Figur 2E). Når terskelverdien er satt til en verdi på 50, utheves alle de aktive sonene i rødt (Figur 2E').
- Definer denne verdien som minimumsterskel. La "Øvre punkteringsterskel" stå på maksimumsverdien.
- Kjør undermakroen Analyser på nytt for de representative bildene med innstillingene som er definert i alle de forrige trinnene i denne delen. Evaluer de resulterende bildefilene kritisk, og kontroller at segmenteringen er riktig utført. Hvis dette ikke er tilfellet, justeres innstillingene på nytt i henhold til segmenteringsfeilene (Figur 1, Tabell 1).
