Дрозофила Нейромышечная развязка (NMJ) Количественная оценка: Метод оценки синаптической морфологии и функции

Overview

Нейромышечное соединение Drosophila (NMJ) используется в качестве модели для изучения морфологии и функции синапсов. Это видео описывает важные особенности, которые исследователи количественно охарактеризовать NMJ. Пример протокола демонстрирует программное обеспечение, способное выполнять количественную оценку автоматически.

Protocol

Этот протокол является выдержка из Кастельс-Нобау и др.,Два алгоритма для высокой пропускной способности и многопаметрической количественной оценки Drosophila N евромышечнойморфологии соединения, J. Vis. Exp. (2017).

1. Требования до обработки изображений

1. Выполните Drosophila открытой подготовки книги третьего instar блуждающих личинок (L3), как описано ранее.
2. Терминалы Co-immunolabel Drosophila NMJ используют комбинацию из двух маркеров: Dlg-1 или Hrp вместе с Brp для анализа с"Drosophila NMJ Morphometrics", и Syt или Csp вместе с Brp для анализа с"Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
   ПРИМЕЧАНИЕ: Антитела одного и того же вида могут быть объединены путем предварительной маркировки одного с антителом спряжения комплект, таких как Зенон Alexa маркировки комплектов.
3. Image NMJ терминалов с помощью микроскопа выбора, например, флуоресценции (с или без ApoTome) или конфокальные микроскопии.
   1. Приобрети 2-канальный стек изображений терминала NMJ.
      1. Отрегулируйте настройки микроскопа таким образом, чтобы первый канал приобрел терминал NMJ с иммунозабелён Dlg-1 (или Hrp, Syt, Csp) и канал 2 терминала NMJ с иммунолабелом Brp.
      2. Дополнительно проанализируйте одноканальные изображения (синапсов с иммунолабелом с одним антителом) с макросами. Изображение NMJs иммунолабеля уникально с Dlg-1 или Hrp для анализа с"Drosophila NMJ Morphometrics", или Syt или Csp для"Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
         ПРИМЕЧАНИЕ: Невозможно проанализировать синапсы, окрашенные только анти-Brp.
   2. Экспорт полученных изображений в качестве отдельных .tiff файлов. Инвертировать заказ канала до запуска макросов, если не приобретен, как указано.

2. Требования к программному обеспечению и установка

1. Скачать макросы:"Drosophila NMJ Morphometrics" и"Drosophila NMJ Бутон Morphometrics" со следующего сайта: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399.v1.
2. Переместите курсор в папку "Macros update 1" и нажмите на опцию "вид". Появится список с содержанием этой папки. Папка содержит макросы"Drosophila NMJ Morphometrics" и"Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оба макроса совместимы с версиями 1.4 Фиджи, которые также представлены в той же папке. Макросы могут не работать в последних версиях. Пожалуйста, используйте предоставленную версию 1.4. Это непроблемно, чтобы начать эту версию, даже на компьютерах с более последней версии Фиджи доступны.
3. Нажмите на кнопку "Загрузить все". Содержимое папки будет загружено на компьютер в качестве .zip файла. Распаковать загруженный файл.
4. Копировать Drosophila_NMJ_Morphometrics.ijm и Drosophila_NMJ_Bouton Morphometrics.ijm файлов Fiji.app/plugins/ каталоге. При перезапуске программы макросы будут отображаться в нижней части меню высадки Plugins.

3. Запуск Суб-макро "Преобразование в стек" для создания проекций и гиперстах изображений NMJ

1. Начните графический интерфейс, выбрав Plugins в панели инструментов и выберите"Drosophila NMJ Morphometrics" в меню высадки.
2. Определите параметр «Уникальная строка файлов» в графическом интерфейсе макроса.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение микроскопа использует идентификационную подпись для организации плоскостей и каналов при хранении стеков в качестве отдельных .tiff файлов. Введенная уникальная настройка строки файла должна указать подпись, назначенную программным обеспечением первому плоскости Первого канала (важно: должен быть указан самый низкий номер самолета и канала).
3. Выберите только суб-макро "Преобразовать в стек" и нажмите кнопку "ОК" и выберите папку, где изображения расположены. Если выбран главный каталог с несколькими субфолдерами, все отдельные файлы '.tiff в главном каталоге и субфолдере, соответствующие уникальным критериям строки файлов, будут обработаны.
   1. Если z-стек содержит только один канал, выберите коробку "Только для Первого канала".
4. Обратите внимание, что два новых файла на изображение NMJ, по умолчанию stack_image_name и flatstack_image_name будут отображаться. Храните только эти стек и плоский стек для дальнейшего анализа. На .tiff можно удалить серию файлов, минимизируя необходимые емкости для хранения и избегая потенциальных источников ошибок.

4. Запуск суб-макро "Определить рентабельность инвестиций", чтобы разграничить NMJ Терминал интересов

1. Запустите графический интерфейс"Drosophila NMJ Morphometrics".
2. Выберите только флажок "Define ROI" и нажмите "OK" и выберите главный каталог, где хранятся изображения, озаглавленные flatstack_name, и нажмите "Выберите". Суб-макро "Определить рентабельность инвестиций" автоматически ищет через все субфолдеры в выбранном главном каталоге.
3. Когда откроется первая проекция, выберите инструмент "Freehand selections" в панели инструментов.
4. С помощью мыши нарисуйте выделение, которое содержит исключительно полный терминал NMJ, представляющий интерес, и нажмите кнопку "OK" в окне "Определить терминал". Макрос будет переходить к следующему прогнозу.
5. Очертить следующую рентабельность инвестиций и повторять до тех пор, пока не будут определены все ИИ. Файл изображений ROI, названный "roi_image_name", будет храниться в том же каталоге, что и ранее созданный стек и проекционные изображения для каждого из обработанных изображений. Выход этого суб-макро является двоичным изображением рентабельности инвестиций в белом на черном фоне.

5. Запуск суб-макро "Анализ" для количественной оценки NMJ Терминал Особенности

1. Перейдите к панели инструментов, выберите "Plugins" и используйте:
   "Drosophila_NMJ_Morphometrics" при анализе синапсов иммунолабеля с анти-Dlg-1 или анти-Hrp (канал 1) вместе с анти-Brp (канал 2), или"Drosophila_NMJ_Bouton_Morphometrics" при анализе синапсов иммунолабеляется анти-Syt или анти-Csp (канал 1) вместе с Brp (канал 2).
   1. При анализе стеков изображений одного канала (структурный канал Dlg-1 или HRP для "Drosophila_NMJ_Morphometrics", или Syt или Csp для"Drosophila_NMJ__Bouton_Morphometrics"), выберите коробку "Только для Первого канала".
2. Отрегулируйте шкалу, соответствующую изображениям, которые будут проанализированы.
   1. Если один пиксель на изображении соответствует 2,5 мкм, укажите Шкала-Пиксели No 1, Масштаб-Расстояние в 2,5. В случае, если оба параметра остаются на уровне 0, область NMJ, периметр, длина и длинная длина ветки будут выражены в количестве пикселей.
3. При необходимости отрегулируйте настройки анализа макроса по умолчанию. Выполняйте корректировки только в том случае, если суб макро "Анализ" ранее был запущен с неудовлетворительными результатами (см. конец этого раздела и раздел 6 для инструкций по оптимизации настроек).
4. Выберите флажки "Анализ" и "Подождите" и нажмите "ОК".
   1. Выберите чек-бокс "Подождите" при запуске суб-макро "Анализ" на 2 канала изображений. В противном случае ошибки в подсчете активных зон могут возникнуть из-за ограниченных возможностей компьютера.
5. Когда откроется новое окно «Выберите каталог», выберите каталог, где находятся изображения, и нажмите «выберите». Макрос будет анализировать все изображения, хранящиеся в главном каталоге, и, если это применимо, последующие папки (с использованием трех файлов от выполнения предыдущих под макросов: stack_image_name, flatstack_image_name и roi_image_name). Макро обрабатывает каждое изображение индивидуально и последовательно. Это может занять несколько минут на стек изображения (в зависимости от емкости компьютера).
6. После запуска макроса обратите внимание, что в родительской папке будет создан новый res_image_name с именем, который будет использоваться для каждого анализируемого синапса. Количественные измерения будут храниться в качестве файла ".txt".
7. Проинспектировать все изображения результатов, чтобы обнаружить и исключить изображения с ошибками сегментации. Возможные ошибки сегментации описаны в таблице 1,а также советы, как настроить настройки, чтобы обойти эти ошибки. В качестве примеров на рисунке 1 приводятся изображения результатов с такими ошибками сегментации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При запуске макроса с настройками по умолчанию, наблюдаемыми в пользовательском интерфейсе, точность приблизительно 95% при сравнении макрои оценки с ручной оценкой.

6. Отрегулируйте макроу настройки к изображениям

1. Когда более 5% изображений показывают ошибки сегментации, исследуйте различные алгоритмы, чтобы определить/выбрать наиболее подходящие настройки макроса для изображений.
2. Отрегулируйте значение радиуса подвижного шара
   ПРИМЕЧАНИЕ: Функция радиуса подвижного шара вычитает фон изображения. Эта функция имеет решающее значение при работе с изображениями, приобретенными на флуоресценции микроскопов и / или когда изображения имеют высокий фоновый шум. Вычитание фона поможет автоматическим пороговым шагам макроса по обеспечению адекватной сегментации терминалов NMJ.
   1. Выберите три stack_image_name изображений, генерируемых суб-макро "Преобразование в стек". Выберите изображения, которые являются репрезентативными для набора данных изображения.
   2. В панели инструментов выберите изображение | Цвет | Разделенные каналы. Будут созданы два стека изображений, один из которых будет представлять первый канал и другой канал 2, соответственно, и сохранить их.
   3. Откройте стек изображений, принадлежащий первому каналу, соответствующему Dlg-1, Hrp, Syt или Csp immunolabeling.
   4. Вы запустите фильтр "Subtract background", выбрав "Process" в панели инструментов, а затем "Subtract Background..." в меню высадки.
   5. Нажмите на флажок предварительного просмотра во всплывающем окне и отрегулируйте радиус подвижного шара до значения, наиболее подходящего для изображений. Параметр "Радиус подвижного шара" должен быть скорректирован на значения, которые увеличивают контраст между синапсом и фоном (см. рисунок 2A').
      1. Например, смотрите рисунок 2. В панели А части синапса показывают те же серые уровни, что и фон, в то время как на рисунке 2 панели А "радиус подвижного шара" из 500 приводит к сильному контрасту между синапсом и фоном.
   6. Создайте z-проекцию, выбрав в панели инструментов Image | Стек| - проекция, выбрать тип проекции - Максимальная интенсивность и сохранить полученное изображение. Когда будет определено соответствующее значение для радиуса подвижного шара, запустите алгоритм "Вычитание фона" на оставшихся репрезентативных изображениях с тем же значением радиуса подвижного шара. Создайте прогнозы и сохраните их (в любом каталоге).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Значение радиуса подвижного шара для 8-битных или RGB изображений должно быть по крайней мере таким же большим, как радиус крупнейшего объекта на изображении, который не является частью фона. Для 16-битных и 32-битных изображений радиус должен быть обратно пропорционален диапазону значений пикселей.
3. Определите различные авто пороги, которые будут использоваться
   1. Откройте прогнозы, сохраненные на предыдущем этапе (6.2.6) и выберите | Отрегулируйте | АвтоТресхолд | Попробуй все.
   2. В качестве двоичного порогового результата изображение появится со всеми различными алгоритмами автоматического порога, определите наиболее подходящий алгоритм для изображений.
      1. При запуске макроса позже измените порог в настройках макроса соответствующим образом.
      2. Используйте более ограничительные пороги, такие как "RenyiEntrophy" или "Моменты", как порог контура NMJ и более разрешительные пороги, такие как "Li" для определения скелета NMJ, и "Хуан" для определения активных зон. Когда изображения очень острые практически без фона, используйте "Хуан" как "NMJ план порога. В противном случае части синапса могут быть отсутствуют после сегментации изображения.
      3. Например, смотрите рисунок 2 B. Соответствующая сегментация синапса получена с помощью автоматических порогов, выделенных зелеными коробками. Некоторые примеры не подходящих порогов выделены красными коробками (проверка синапсов при высоком увеличении). В последнем, либо части синапса отсутствуют или части фона включены.
4. Определить максимальный размер мелких частиц
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта функция исключит из анализа все частицы, обнаруженные порогом контура NMJ и порогом скелета, которые меньше определенного значения в "параметре мелких частиц". Это значение определяется в пикселях. Эта функция служит шумовым фильтром и очень полезна, когда на полученных изображениях присутствуют высокие показатели не однородного фона (например, кристаллов/пыли).
   1. Откройте прогнозы, сохраненные в шаге 6.2.6. и установить шкалу для обнаружения количества пикселей с помощью анализа | Установить шкалу. Примените следующие параметры: расстояние в пикселях No 1, известное расстояние 1, соотношение пиксельных аспектов No 1, единица длины пикселя и нажмите "Ok". Нажмите на инструмент "Овальный выбор" в панели инструментов.
   2. С помощью мыши сделать выбор тесно окружающих отдельных частиц, которые присутствуют в иммуностимуляторов, но не принадлежат к NMJ. Нажмите Ctrl'm для пользователя Windows или cmd'm для пользователей Mac. Окно результата откроется, указывая область частиц, выбранных по количеству пикселей.
   3. Повторите предыдущий шаг несколько раз с несколькими артефактами, присутствующими на изображениях, чтобы определить самую большую загрязненную область частиц/артефакта. Это будет значение, которое будет установлено в настройках при запуске макроса позже. При запуске макроса установится "Размер мелких частиц", так как при малейшем размере частиц наблюдается гной маржа в 25%.
   4. Например, смотрите рисунок 2 D. Самый большой обнаруженный кристалл имеет площадь 112 пикселей. Параметр "Размер мелких частиц" при обработке этого изображения макросом должен быть установлен на 125 - 150.
5. Определить минимальный размер бутона
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта функция исключит из анализа все бутоны, обнаруженные порогом контура NMJ, которые меньше определенного значения. Это значение определяется в пикселях.
   1. Следуйте тем же шагам, что описано в разделе 6.4, но в этом случае нарисуйте выбор вокруг самых маленьких бутонов, присутствующих в терминале NMJ. Выберите малейший район, соответствующий самой маленькой бутону измеренных. Это значение, чтобы установить в минимальном параметре размера бутона при запуске макроса позже.
6. Определить значение "Толерантность к шуму Maxima"
   1. Чтобы определить значение "Найти максимальную шумоустойчивость" для макроса, откройте канал 2 и стек, сохраненный в разделе 6.2.2.
   2. Перейдите на вкладку плагинов во всплывающем меню, выберите process | Максимум (3D), и когда maximum_image_name появляется (что может занять несколько минут), закройте исходный стек изображения.
   3. Выберите Maximum..._image_name (недавно полученный стек изображений) и выберите Plugins | Процесс | Минимальный (3D), когда новое изображение Минимум Maximum..._image_name apears закрыть _image_name ...
   4. В панели инструментов выберите процесс | Найти максима .... Новое окно "Найти максима..." откроется. Нажмите на флажок "Предварительный выбор точей..." и заполните поле "Шумоустойчивость" параметром макрос 50 по умолчанию. Точки максимы будут указаны на изображении как маленькие кресты.
      1. Увеличьте значение «толерантность к шуму» при наблюдении превышения аннотированных активных зон, т.е. крестов, которые не находятся поверх активных зон, которые не сосредоточены на выбранной плоскости стека, или ложных активных зон, которые обнаруживаются в фоновом режиме.
         1. С другой стороны, при наблюдении неполно аннотированных активных зон, т.е. не распознаваемых активных зон фокуса, уменьшится значение «толерантности к шуму Maxima». Продолжайте пробовать различные значения, следующие за этой процедурой, пока кресты не будут надлежащим образом маркировать активные зоны в фокусе. Заполните "Найти максимальную шумоустойчивость" с этим значением.
         2. Например, смотрите рисунок 2 C. Обнаружено слишком много активных зон. На рисунке 2C при увеличении значения «толерантности к шуму Maxima» обнаруживаются только активные зоны в фокусе.
   5. Запустите суб-макро "Анализ" для репрезентативных изображений, выбранных в шаге 5.1, с настройками, определенными во всех предыдущих шагах.
7. Отрегулируйте нижний и верхний порог Brp-puncta
   1. Обратите внимание, что новый файл будет появляться после запуска макроса в соответствии с шагом 6.6, 2_active_zone_stack_image_name. В этом стеке изображений активные зоны, обнаруженные функцией «Найти максима», обозначены белыми точками в каждой плоскости.
   2. Откройте этот файл, перетащив и сбросив его в панель инструментов и выберите | Стек | Вопрос-проект | Тип проекции и срезы суммы. Будет получена проекция 2_active_zone_stack_image_name будут получены.
   3. Выберите изображение | Отрегулируйте | порог. Откроется новое окно "Порог". Сдвиньте верхнюю планку, чтобы выбрать пороговое значение, где все желаемые очаги/brp-положительные пятна визуализированы красным цветом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если порог установлен слишком низким, будет засчитано превышение активных зон. Если установить слишком высокий уровень, часть активных зон будет пропущена.
      1. Например, смотрите рисунок 2 E. Когда порог установлен до 400, большинство активных зон (символизируемых как 1 пиксель foci) не включены в сегментацию, так как они не выделены красным цветом(рисунок 2E). Когда порог установлен на значение 50, все активные зоны выделены красным цветом(рисунок 2E').
   4. Определите это значение как минимальный порог. Оставьте "Верхний пункта порог" на максимальное значение.
   5. Повторное запуск под макро "Анализ" для репрезентативных изображений с настройками, определенными на всех предыдущих этапах этого раздела. Критически оцените полученные файлы изображений и убедитесь, что сегментация выполнена должным образом. Если это не так, скорректировать настройки в соответствии с характером ошибок сегментации(рисунок 1, таблица 1).

Representative Results

Рисунок 1: Примеры неуместных результатов макро сегментации. Результат изображения после запуска"Drosophila NMJ Morphometrics" или"Drosophila NMJ Бутон Morphometrics". Части синаптической терминала не включены в желтый контур(A). Части фона включены в синаптический терминал желтым контуром(B). Голубая линия скелета простирается за пределы синаптической терминала(C - D). Обнаружено слишком много активных зон(E - E'). Некоторые активные зоны остаются незамеченными анализом(G - G'). Активные зоны обнаруживаются за пределами синапса(F). Неправильная сегментация бутона (применяется только при запуске Drosophila NMJ Bouton Morphometrics), бутоны пропущены(H) или слишком много бутонов обнаруживаются сегментации (I). Частицы таких кристаллов или пыли, которые являются частью фона включены в сегментации (J). Информация о том, как изменить настройки, чтобы избежать этих ошибок, представлена в таблице 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Примеры макро-настройки корректировки и их последствия для сегментации изображений. (A) Вычесть фон предварительного Dlg-1 иммунолабеленый синапс, изображенный на флуоресценции микроскопа с ApoTome, когда "Rolling Ball радиус" установлен на 20 (A) или 500 (A '). (B)Выходные изображения, полученные после запуска Image | Отрегулируйте | Авто-пороговый | Попробуйте все изображения иллюстрирует сегментации изображений, полученные 16 различными алгоритмами автоматического порога. (C) Предварительный просмотр "Найти Максима" при настройке "Шумоустойчивость" на 50(C) и 500(C'); Активные зоны, которые обнаруживаются сегментацией, обозначены небольшим крестом. (D) Измерение "малых частиц", появляющихся на фоне изображения синапса иммунолабеля с анти-Hrp, изображенный на конфокальный микроскоп. (E)"Сумма ломтиками" проекция, полученная 2_active_zone_stack_ima-ge_name. Порог установлен на уровне 400(E) и на уровне 50(E'). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

сегментация	Наблюдаемые ошибки	пример	Необходимые корректировки
NMJ Площадь и периметр (Представлено желтым контуром в результате изображения)	Части синаптического терминала либо не включены в желтом контуре или части фона включены в синаптический терминал, очерченный желтым цветом.	Рисунок 2A-B	Отрегулируйте значение 'Rolling Ball Radius'. Смотрите раздел 6.1.	Отрегулируйте порог контура NMJ. Смотрите раздел 6.2.
Параметры длины NMJ (Представлено синей линией скелета на изображении результатов)	Голубая линия скелета либо простирается за пределы, либо не присутствует вдоль всего синаптического терминала.	Рисунок 2C-D	Отрегулируйте значение 'Rolling Ball Radius'. Смотрите раздел 6.1.	Отрегулируйте порог контура NMJ. Смотрите раздел 6.2.
Brp-положительная панкта (Представлено точками в изображении результатов)	Обнаружено слишком много активных зон.	Рисунок 2E-E'	Снижение значения «Найти максимальную шумоустойчивость». Смотрите раздел 6.5.
Brp-положительная панкта (Представлено точками в изображении результатов)	Активные зоны пропущены анализом.	Рисунок 2G-G'	Увеличьте значение «Найти максимальную шумоустойчивость». Смотрите раздел 6.5.	Снижение 'Brp-puncta нижнего порога'. Смотрите раздел 6.6.
Brp-положительная панкта (Представлено точками в изображении результатов)	Обнаружены артефакты активных зон за пределами синаптической терминала.	Рисунок 2F	Отрегулируйте раздел 6.2 «Порог активной зоны».	Увеличьте нижний порог 'Brp-puncta'. Смотрите раздел 6.6.
Мелкие частицы	Частицы, такие как кристаллы или пыль, которые являются частью фона, как представляется, включены в сегментации.	Рисунок 2J	Выберите поле 'Удалить мелкие частицы'. Смотрите раздел 6.3.	Определите максимальный размер мелких частиц. Смотрите раздел 6.3.
Сегментация Бутона	Неправильная сегментация бутона (Применяется только к Drosophila NMJ Bouton Morphometrics; не используйте Drosophila NMJ Morphometrics для сегментации бутона).	Рисунок 2H-I	Отрегулируйте порог контура NMJ. Смотрите раздел 6.1.	Определите «минимальный размер бутона». Смотрите раздел 6.4.

Таблица 1: Руководство по устранению неполадок для различных видов ошибок в сегментации изображений, которое может быть подготовлено Macros. В этой таблице описаны различные виды ошибок сегментации изображений, производимых макросами. Они могут быть легко обнаружены в результатах изображения. Примеры каждого типа ошибок приведены на рисунке 1. В разделе "корректировки" таблицы выделены настройки, которые необходимо отрегулировать, и пользователь упоминается на критическом подшагоме раздела 6, в котором описывается, как настроить эти настройки.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunostaining			Dilution
Mouse anti-discs large 1	Developmental Studies Hybridoma Bank	AFFN-DLG1-4D6	1/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)
Rabbit anti-horseradish peroxidase	Jackson IR	323-005-021	1/500
Rabbit anti-Synaptotagmin	Gift from Hugo Bellen		Jan-00
Mouse anti-Cysteine string protein	Developmental Studies Hybridoma Bank	DCSP-1(ab49)	1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)
Mouse anti-Bruchpilot	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Jan-50
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488	Life technologies	A11029	1/200
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568	Life technologies	A11011	1/500
Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit	ThermoFisher	Z25006
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher	P36930
Equipment
Confocal microscope or fluorescence microscope	Leica SP5
Zeiss Axio imager
Computer	Mac or Pc
Software
FIJI