Lésions neuronales induites par laser à deux photons : une méthode pour observer la dégénérescence et la régénération de l’axon chez les larves de Drosophila

Overview

Cette vidéo décrit l’ablation au laser à deux photons d’axones dans une larve de drosophile melanogaster et un protocole d’exemple pour induire des blessures et l’image du site de blessure.

Protocol

Ce protocole est un extrait de Li et coll.,A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System, J. Vis. Exp. (2018).

1. Blessure à deux photons et imagerie confocale

1. Configuration du microscope
   REMARQUE: Un microscope à balayage laser confocal avec un laser à deux photons a été utilisé pour cette expérience, mais d’autres systèmes avec une configuration équivalente suffiront également. Le laser à deux photons (930 nm) a été utilisé pour fournir des blessures et un laser Argon (488 nm) a été utilisé pour l’imagerie confocale de GFP.
   1. Au début de chaque séance, allumez le laser à deux photons et/ou le laser confocal et le microscope. Ouvrez le logiciel d’imagerie.
   2. Pour les blessures à deux photons, mettre en place les paramètres suivants pour l’imagerie GFP avec le laser à deux photons à 930 nm (1950 mW).
      1. Sélectionnez le mode d’analyse en ligne. Ouvrez le sténopé jusqu’a où. Augmenter l’intensité du laser à ~20% (390 mW).
      2. Sélectionnez 512 x 512 comme scan du cadre. Utilisez la vitesse de balayage maximale (généralement avec le temps de vie pixel à 0,77 μs). Assurez-vous que le nombre moyen est de 1 et la profondeur du bit est de 8 bits.
      3. Réglez le gain à ~750, et le décalage à 0.
      4. Enregistrez ce protocole expérimental préédent sous le nom d’Ablation 2P GFP 930,permettant une réutilisation facile dans de futures expériences.
   3. Pour l’imagerie confocale, configurer les paramètres suivants pour l’imagerie GFP avec le laser Argon à 488 nm :
      1. Sélectionnez l’onglet Acquisition, puis Z-stack.
      2. Sous "Laser« , allumez la puissance du laser Argon de 488 nm.
      3. Allez aux canaux,sélectionnez le laser de 488 mm, et augmentez la puissance laser à 5-10%. Pour le sténopé, utilisez l’unité aérosée 1-2 (UA). Ajustez le gain à 650.
      4. En mode Acquisition, sélectionnez 1024 x 1024 comme scan cadre, utilisez la vitesse de balayage maximale, un nombre moyen de 2, et la profondeur du bit de 8 Bit.
      5. Enregistrez ce protocole expérimental prédéfiguré sous le nom de GFP Imaging.
2. Anesthésie de larves avec l’éther et le montage de diététhyle
   1. Dans une hotte fumigène, déposer un plat en verre de 60 mm dans une boîte de Pétri en plastique de 15 cm. Pliez et mentez un morceau de papier de soie au fond du plat en verre, puis placez une assiette d’agar de jus de raisin sur le tissu. Ajouter l’éther de déthyle dans le plat en verre, au point où le papier de soie est trempé et il reste une couche d’éther liquide dans le plat. Gardez le couvercle en tout temps.
   2. Préparer une glissade en verre avec une goutte d’huile d’halocarbone 27 au centre. Ajouter 4 taches de graisse sous vide sur les quatre coins de la lame, pour soutenir plus tard le coverslip.
   3. Utilisez des forceps pour ramasser une larve nettoyée et placez-la sur la plaque d’agar dans le plat en verre de 60 mm. Couvrir le plat en verre avec son couvercle et attendre que la larve cesse de bouger. Pour les blessures/imagerie PNS, sortez la larve dès que sa queue cesse de trembler. Pour le SNC, attendez que toute la larve devienne immobile, en particulier les segments de tête.
      REMARQUE: Le moment de l’exposition à l’éther est critique. Voir Discussion.
   4. Ramassez soigneusement la larve anesthésiée et placez-la tête haute dans la goutte d’huile d’halocarbone sur la lame. Ajouter un coverslip sur le dessus de la diapositive. Utilisez une pression douce pour pousser vers le bas sur le coverslip, jusqu’à ce qu’il touche la larve (Figure 1A).
   5. Ajustez la position de la larve en poussant doucement le coverslip vers la gauche ou la droite pour rouler la larve, de sorte que le neurone/axone/dendrite d’intérêt est sur le dessus et le plus proche de la lentille de microscope.
   6. Pour les blessures de PNS, montez le côté dorsal de larve vers le haut, de sorte que les deux trachées soient visibles. Puis rouler la larve ~ 30 degrés à gauche pour blesser les axones de classe III da neurone (Figure 1B et 1C), 90 degrés pour blesser la classe IV da axones neurones (Figure 1B et 1E), ou ~ 30 degrés pour blesser la classe IV da neurone dendrites ( Figure2A).
   7. Pour les blessures causées par le SNC, placez la larve pour qu’elle soit parfaitement ventrale vers le haut (figure 3A), de sorte que la région d’intérêt soit la plus proche de la lentille du microscope dans le plan Z.
3. Blessure par laser à deux photons
   1. Placez la lame avec la larve sous le microscope et fixez-la en place avec le porte-glissière sur la scène. Utilisez l’objectif 10X (0.3 NA) pour trouver la larve.
   2. Ajouter 1 goutte d’huile objective sur le coverslip, passer à l’objectif 40X (1.3 NA) et ajuster la mise au point.
   3. Passez au mode de numérisation et réutilisez le protocole expérimental 2P GFP 930 Ablation. Assurez-vous que le sténopé est ouvert tout le chemin.
      REMARQUE: La configuration doit être optimisée en fonction de systèmes individuels.
   4. Démarrez le mode Live pour localiser la région d’intérêt (ROI) et affiner les paramètres pour obtenir une bonne qualité d’image avec le zoom approprié.
      REMARQUE: Le but de cette étape est de trouver le neurone / axon / dendrite à blesser, plutôt que de prendre la meilleure image de qualité. Par conséquent, utilisez les paramètres minimaux suffisants pour visualiser la zone cible, afin d’éviter la surexposition ou le photobleaching.
   5. Arrêtez l’analyse en direct, de sorte que le bouton Crop sera disponible. Que l’image fixe serve de feuille de route. Sélectionnez la fonction Crop et ajustez la fenêtre d’analyse pour vous concentrer sur la cible à blesser.
   6. Réduisez le retour sur investissement pour être de la taille du site potentiel de blessure. Par exemple, il suffit de couvrir la largeur d’un axon ou d’un dendrite, pour assurer la précision de la blessure et réduire les dommages aux tissus voisins. Si vous le souhaitez, zoomez sur le retour sur investissement avant de recadrage, ce qui permet des blessures plus précises.
   7. Ouvrez une nouvelle fenêtre d’imagerie. Réduisez la vitesse de balayage et augmentez l’intensité du laser. Déterminer l’augmentation de l’intensité laser en fonction du signal de fluorescence tissulaire scanné en mode Live.
   8. En règle générale, réglez l’intensité laser à deux photons à partir de 25% pour les blessures PNS et 50-100% pour les blessures VNC. Pour les blessures à l’axon PNS, assurez-vous que l’intensité du laser est d’environ 480 mW et que le temps de vie des pixels est de 8,19 μs. Pour la blessure à l’axon VNC, assurez-vous que l’intensité du laser et le temps de vie des pixels sont généralement de 965-1930 mW et 8,19-32,77 μs, respectivement.
   9. Démarrer l’analyse continue. Laissez le curseur planer sur le bouton Continu. Gardez un œil attentif sur l’image et arrêtez l’analyse dès qu’une augmentation drastique de la fluorescence est observée.
      REMARQUE: L’apparition de la pointe de fluorescence est due à l’auto-fluorescence sur le site de la blessure.
   10. Revenez au mode Live en réutilisant les paramètres. Trouvez la région d’intérêt qui vient d’être ciblée en ajustant l’orientation.
       REMARQUE: Une bonne indication de blessures réussies est l’apparition d’un petit cratère, d’une structure en forme d’anneau ou de débris localisés directement sur le site de la blessure.
   11. Passez au neurone suivant et répétez de l’étape 1.3.5, pour blesser plusieurs neurones chez un seul animal. Ou répétez l’étape 1.3.5 tout en augmentant graduellement la puissance et/ou en réduisant la vitesse d’analyse si la blessure initiale était insuffisante.
       REMARQUE: Dans le cas où la puissance laser est trop élevée, une grande zone endommagée sera visible dans l’image de balayage en direct post-blessure. Trop de blessures peuvent causer la mort de la larve.
   12. Récupérer la larve en enlevant soigneusement le coverslip et en transférant la larve blessée sur une nouvelle plaque avec de la pâte de levure. Jeter plusieurs grottes sur la plaque d’agar avec des forceps; alternativement, faire une île d’agar dans la plaque au lieu d’utiliser toute la plaque, pour réduire la possibilité de la larve rampant hors de la plaque.
   13. Mettez l’assiette dans une boîte de Pétri de 60 mm avec du tissu humide (trempé avec une solution d’acide propionique à 0,5 % ) et de la culture à température ambiante ou à 25 °C.
       REMARQUE: La larve restera au stade larvaire pendant environ une journée supplémentaire à température ambiante (22 °C) contre 25 °C.
4. Imagerie confocale post-blessure
   1. Imagez la larve blessée aux points de temps désirés en préparant la larve en utilisant la même procédure d’anesthésie et de montage que dans l’étape 1.2, puis l’imagerie avec le laser confocal.
      REMARQUE: Image de la larve à 24 h après une blessure (IA) pour confirmer les lésions axonales et à 48 h IA (classe IV da neurones) ou 72 h IA (classe III da neurones) pour évaluer la régénération.
   2. Localiser la larve à l’aide de l’objectif 10X, puis passer à un objectif 25X (0,8 NA). Réutiliser le protocole expérimental GFP Imaging.
   3. Cliquez sur le bouton Live et trouvez le même neurone blessé précédemment.
   4. Définissez les premières et dernières positions Z dans la fenêtre d’analyse en direct. Appuyez sur arrêter et cliquez sur Démarrer l’expérience pour acquérir une image Z-stack.
      REMARQUE: Assurez-vous qu’un point de normalisation (le point convergent de l’axon) est inclus lors de la capture d’images afin que la quantification de la régénération soit possible (figure 1D, 1F) – cela est discuté plus en détail dans la section analyse des données.
   5. Passez au traitement d’image,sélectionnez l’image qui vient d’être prise et générez une projection d’intensité maximale. Enregistrez à la fois les images de projection z-stack et d’intensité maximale.

Representative Results

Figure 1 : La régénération de l’axone des neurones Da dans la périphérie affiche la spécificité de la classe. (A et B) Dessin schématique montrant la position des larves. (C) Dessin schématique des neurones de classe III da. (D) Axones de la classe III da neurones ddaF, étiquetés avec 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80/+, ne parviennent pas à repousser. (E) Dessin schématique de classe IV da neurones. (F) Axones de la classe IV da neurones v’ada, étiquetés avec ppk-CD4-tdGFP/+, repoussent au-delà du site de lésion. (D et F) La ligne rouge indique la longueur de l’axon tandis que la ligne verte pointillée marque la distance entre le corps cellulaire et le point de convergence axon (DCAC). Le point bleu marque le point convergent de l’axon. Barre d’échelle = 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Régénération de dendrite de neurone de Da. (A) Représentation illustrative des neurones de classe IV da. (B) Représentation illustrative de la régénération de dendrite dans la classe IV da neurone ddaC, étiquetée par ppk-CD4-tdGFP/+. L’ablation au laser est ciblée sur le point de branche primaire et est effectuée à 48 h AEL. À 24 h, la transection du neurite par blessure d’IA est confirmée, et à 72 h, la régénération de l’IA est quantifiée. Les dendrites des neurones ddaC démontrent une repousse substantielle, avec de nouvelles branches dendritiques qui poussent de la tige sectionnée pour carreler l’espace vacant. Il convient de noter que de nouvelles branches terminales sont continuellement ajoutées aux dendrites non blessés à ce stade de développement. Barre d’échelle = 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Régénération de l’axone des neurones Da dans le VNC. (A) Dessin schématique d’une larve de Drosophile monté sur une lame et photographié au microscope. Axones de neurone de classe IV dans le VNC visualisés dans une larve ppk-CD4tdGFP/+ Deux segments de commissaire candidat sont affichés dans l’image zoomée et le dessin schématique. Chacun d’eux a deux sites de blessures (cercles rouges). (B) Images confoccales d’un segment blessé photographié à 8, 24 et 72 h après une blessure (IA). Les lignes rouges représentent les axones qui repoussent. (C) Mesure et normalisation des axones de repousse. Barre d’échelle = 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous	Acros Organics	AC615080010
Halocarbon 27 Oil	Genesee Scientific	59-133
Propionic Acid	J.T.Baker	U33007
Cover Glasses: Rectangles	Fisher Scientific	12-544-D	50 mm X 22 mm
Zeiss LSM 880 laser scanning microscope	Zeiss
Zen software	Zeiss
Chameleon Ultra II	Coherent