Microinjeção de Células enfermeiras Drosophila: Um Método de Parto Intracelular

Overview

Devido ao seu grande tamanho e organização relativamente simples, as células enfermeiras de Drosophila são idealmente adequadas para estudos de imagem de células vivas. Este vídeo descreve um método de microinjeção para a entrega de compostos exógenos nas células, e o protocolo em destaque demonstra o procedimento com sondas oligonucleotídeos fluorescentes chamadas de faróis moleculares (MBs) usados para visualizar transcrições de mRNA endógenos.

Protocol

Este protocolo é extraído de Catrina et al., Visualizando e Rastreando mRNAs endógenos em Câmaras de Ovos de Drosophila Live Drosophila, J. Vis. Exp. (2019).

1. Design de MBs para Imagens de Células Vivas

1. Dobre a sequência de RNA de destino para prever a estrutura secundária do alvo mRNA usando o "formulário RNA" do servidor mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
   1. Cole/carregue a sequência de destino no formato FASTA, selecione 5 ou 10% de sub-idealidade (estruturas com uma energia livre de dobra dentro de 5 ou 10% do valor MFE, respectivamente), e ajuste o número máximo de dobras computadas de acordo (por exemplo, maior para 10% de sub-idealidade).
      NOTA: A inclusão de estruturas secundárias sub-ideais ao projetar MBs permite identificar regiões dentro do mRNA alvo que podem ser mais flexíveis ou mais rígidas do que as previstas apenas para a estrutura de energia livre mínima (MFE), o que melhora o design geral de MBs adequados para imagens de células vivas.
   2. Selecione um "trabalho imediato" para metas de mRNA de 800 nucleotídeos (nt), ou um "trabalho em lote" para comprimentos de mRNA entre 801 e 8.000 nt. Salve o arquivo "ss-count" como arquivo de texto simples.
2. Use o arquivo "ss-count" obtido na etapa 1.1 como entrada para o programa PinMol (https://bratulab.wordpress.com/software/)com os parâmetros desejados, para projetar vários MBs para o alvo mRNA (ver tutoriais descrevendo o uso do programa PinMol em https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-mac/).
   1. Determine a especificidade dos MBs selecionados realizando a análise blast: use "blastn" com o banco de dados apropriado (por exemplo, para MBs específicos do oskar mRNA usar o banco de dados "refseq-rna" e o organismo melanogaster Drosophila).
   2. Identificar qualquer expressão específica de tecido do alvo mRNA (por exemplo, para oskar mRNA Flybase> High-Throughput Expression Data> FlyAtlas Anatomy Microarray ou modENCODE Anatomy RNA-Seq; http://flybase.org/reports/FBgn0003015) e comparar com quaisquer hits positivos do BLAST. Elimine sondas que mostram >50% de esmologia cruzada com outros mRNAs que também são expressos no tecido/célula de interesse.
3. Selecione o fluoróforo e o par quencher apropriados para a configuração de microscopia disponível para realizar imagens de células vivas (por exemplo, Cy5/BHQ2).

2. Síntese, Purificação e Caracterização de MB

1. Use síntese interna e purificação como descrito anteriormente em Bratu, Métodos em Biologia Molecular (2006), ou serviços de provedores comerciais, para sintetizar e purificar de um a cinco MBs (ver nota acima), usando o seguinte esquema de rotulagem: [5'(Fluorhoreop)-(Linker C3 ou C6)-(2'-O-sequência mb de metila)-(Quencher)3']. Purificar MBs usando HPLC em fase inversa, em casa ou usando os serviços do provedor comercial.
   NOTA: Os fosforramiditos usados para síntese de sonda automatizada devem ter a modificação de ribonucleotídeo de 2'-O-metil. Pode-se também usar quimeras de ácido alternado-nucleico bloqueado (LNA) e modificações de metila de 2'-O-para aumentar a estabilidade de um híbrido entre um MB mais curto e seu mRNA alvo.
2. Sintetizar oligonucleotídeos de DNA que correspondem à sequência da região de RNA alvo e, portanto, são complementares à região da sonda de MBs, para uso em caracterização in vitro (ver passos 2.3 a 2.5; nota acima). Maximize a hibridização do MB com a mímica de alvo dna-oligonucleotídeo, incluindo em cada extremidade do alvo do DNA quatro nucleotídeos adicionais, como encontrado na sequência mRNA alvo.
   NOTA: Uma caracterização mais rigorosa da eficiência do MB para detectar a sequência direcionada pode ser realizada usando alvos de RNA sintetizados in vitro em vez de oligonucleotídeos complementares de DNA.
3. Realize a desnaturação térmica do MB sozinho, meça sua temperatura de fusão (Tm) e confirme que o MB assume a forma desejada do grampo de cabelo a temperatura fisiológica. Observamos valores Tm entre 60 e 90 °C.
4. Realizar a desnaturação térmica do MB na presença do alvo de oligonucleotídeo de DNA e medir o Tm do híbrido alvo MB:DNA, como descrito anteriormente em Bratu, Métodos em Biologia Molecular (2006). Um Tm entre 55 e 60 °C é desejado para o híbrido MB:DNA.
5. Realizar reações de hibridização in vitro com o alvo correspondente de oligonucleotídeo de DNA, e determinar a eficiência da formação híbrida MB:DNA à temperatura fisiológica, como descrito anteriormente em Bratu, Métodos em Biologia Molecular (2006). Cinética de hibridização rápida com a mímica de alvo de DNA é desejada, porém MBs que não mostram alta eficiência de hibridização com alvos de DNA podem ter um melhor desempenho com o mRNA alvo in vitro e/ou in vivo.

3. Dissecção e Preparação de Câmaras individuais de Ovos para Microinjeção

1. Alimente fêmeas recém-eclodidas e acasaladas por 2-3 dias com pasta de levedura fresca.
2. Anestesize voa em uma almofada de CO₂ e, usando pinças finas (Dumont #5), transfira 1-2 fêmeas em uma gota de óleo de halocarboneto 700 em um deslizamento de tampa de vidro.
3. Usando um par de pinças, oriente a mosca com o lado dorsal para cima sob um estereótipo. Disseque o abdômen feminino fazendo uma pequena incisão na extremidade posterior e aperte suavemente o par de ovários no óleo.
4. Explane os ovários em uma gota de óleo em uma nova mancha de cobertura. Segure suavemente um ovário com uma pinça enquanto belisca os estágios mais jovens do ovário com a outra pinça. oskar mRNA é ativamente localizado em e após a oogênese média (estágios > 7), e câmaras de ovos mais jovens (estágios < 7) são mais difíceis de injetar e não sobrevivem por tanto tempo. Arraste lentamente o deslizamento da tampa (com um movimento descendente) até que os ovários individuais ou câmaras de ovos estejam isoladas e alinhadas verticalmente. Mais separadas câmaras de ovos individuais deslocando os estágios indesejados da cadeia de ovos de ovário.
   NOTA: Certifique-se de que as câmaras de ovos provocadas individualmente não flutuam no óleo, e que elas aderem ao deslizamento da tampa. Isso é importante tanto para a microinjeção de sucesso quanto para a aquisição de imagens.

4. Microinjeção de MBs nas Células enfermeiras das Câmaras de Ovos

1. Prepare a solução MB, usando um farol molecular (por exemplo, osk2216Cy5), ou uma mistura de dois MBs que visam mRNAs diferentes e que são rotulados com fluoroforos espectralmente distintos (por exemplo, osk2216Cy5 e drongo1111Cy3). Use uma concentração de 200-300 ng/μL cada MB em HybBuffer (50 mM Tris-HCl - pH 7.5, 1,5 mM MgCl₂ e 100 mM NaCl). Para um coquetel de quatro MBs rotulados com o mesmo fluoróforo que estão mirando o mesmo mRNA a 200 ng/μL cada em HybBuffer (por exemplo, osk82, osk1236, osk2216). Gire a solução MB imediatamente antes de carregar a agulha para microinjeção.
2. Selecione o objetivo. Recomenda-se um objetivo de óleo de 40x para encontrar uma câmara de ovos apropriada e para a realização de microinjeção.
3. Monte a tampa com câmara de ovo dissecada no estágio do microscópio. Traga o objetivo na posição de foco e identifique uma câmara de ovo em um estágio de desenvolvimento médio-tardio, que é devidamente orientado para microinjeção (ou seja, com o eixo AàP perpendicular à ponta da agulha para permitir uma injeção fácil dentro de uma célula de enfermagem proximal ao oócito).
4. Carregue uma agulha (comercial ou preparada em casa) com a solução ~1 μL MB (ver passo 1.1) e conecte-a ao microinjetor. Para microinjeções em câmaras de ovos de D. melanogaster, oriente a agulha (ver Tabela de Materiais) em um ângulo <45° para o estágio do microscópio (por exemplo, 30°) para evitar perfurar várias células enfermeiras.
5. Configure o injetor com pressão de injeção de 500-1.000 hPa e pressão de compensação de 100-250 hPa (ver Tabela de Materiais).
6. Mova lentamente o palco para trazer no campo de visão uma área do vazio de gota de óleo das câmaras de ovos.
7. Usando o joystick micromanipulador, abaixe suavemente a agulha na gota de óleo e coloque sua ponta em foco para a periferia do campo de visão.
8. Execute uma função 'limpa' para remover o ar da ponta da agulha e para garantir que haja fluxo da agulha.
9. Leve a agulha para a posição de casa e concentre-se na câmara de ovos para ser microinjetada, em seguida, coloque a agulha de volta em foco e posicione-a perto da borda da câmara de ovos.
10. Realize um ajuste fino da posição Z do objetivo de modo que a membrana que separa as células folículos das células enfermeiras esteja em foco.
11. Insira a agulha em uma cela de enfermeira e realize a injeção para 2-5 s.
12. Retire suavemente a agulha e retraia-a para a posição de casa.
13. Alterar o objetivo para a ampliação desejada para aquisição de imagem (60-63x ou 100x), focar na câmara de ovos e iniciar a aquisição.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectrofluorometer	Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon	n/a	Photon counting spectrofluorometer
Quartz cuvette	Fireflysci (former Precision Cells Inc.)	701MFL
Dumont #5 tweezer	World Precision Instruments	501985	Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898
Cover slip No.1 22 mm x 40 mm	VWR	48393-048
Dissecting microscope	Leica MZ6 Leica Microsystems Inc.	n/a
CO2 fruit fly anesthesia pad	Genesee Scienific	59-114
Tris-HCL pH 7.5	Sigma-Aldrich	1185-53-1
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	7791-18-6
NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Spinning disc confocal microscope	Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc.	n/a
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera	Hamamatsu	n/a
PatchMan NP 2 Micromanipulator	Eppendorf Inc.	920000037
FemtoJet Microinjector	Eppendorf Inc.	920010504
Injection needle: Femtotips II	Eppendorf Inc.	930000043
Loading tip: 20 μL Microloader	Eppendorf Inc.	930001007
Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22 mm x 40 mm	VWR	48393-026; 48393-172
Dry yeast	Any grocery store	n/a
Computer, > 20 GB RAM			Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing