Screening for genomiske modifikationer: En metode til at identificere CRISPR-genererede mutanter i Drosophila

In This Article

Abstract

Kilde: Du, L., et al. En effektiv strategi for generering af vævsspecifikke binære transskriptionssystemer i Drosophila ved genomredigering. J. Vis. Exp. (2018).

Denne video beskriver en screening metode til at identificere transgene Drosophila fluer, hvis genom blev ændret ved hjælp af CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 er et kraftfuldt genomredigeringsværktøj, der revolutionerede den måde, hvorpå forskere kan manipulere en organismes genom. I eksempelprotokollen vil vi se, hvordan vi identificerer CRISPR-genererede mutanter, hvor en indsættelse af en transaktiveringssekvens erstatter den første exon af det branchless (bnl) gen, hvilket skaber en bnl genspecifik driverlinje, bnl-LexA.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Du et al.,En effektiv strategi for generering af vævsspecifikke binære transskriptionssystemer i Drosophila ved genomredigering, J. Vis. Exp. (2018).

1. Flyvegenetik og screening (figur 1 og figur 2)

Når de injicerede embryoner udvikler sig til voksne, krydser hver enkelt G₀ fluer til balancer fluer. Vælg passende balancer til kromosomet, der indeholder den målrettede allel.
Bedøve F1 afkom fra hver G0 tværs på en CO₂ pad og tilfældigt vælge 10-20 mænd under et stereomikroskop. Kryds dem individuelt til balancerhunnerne som vist i figur 2.
Når F2 larverne klækkes, skal du vælge den enkelte F1-far fra hvert kryds og udtrække gDNA ved hjælp af den enkelte flyve genomiske DNA-forberedelsesprotokol:
1. Forbered gDNA ekstraktionsbuffer: 10 mM Tris-Cl pH 8.2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl, opbevar ved stuetemperatur. Forbered 20 mg/mL Proteinase K lageropløsning og opbevares i fryseren.
2. Sæt hver flue i et 1,5 mL mikrocentrifugerør og mærk røret. I fryseren på -80 °C natten over.
3. Der fremstilles et nyt arbejdsvolumen af gDNA-ekstraktionsbuffer, der indeholder 200 μg/mL endelig koncentration af Proteinase K.
  Bemærk: Brug ikke en gammel buffer til dette trin.
4. Squish hver flyve i 10-15 s med en pipette spids indeholder 50 μL squishing buffer uden at dispensere væsken. Dispenser den resterende buffer i røret og bland godt. Inkuber ved 37 °C i 20-30 min.
5. Sæt rør i 95 °C varmeblok i 1-2 minutter for at inaktivere Proteinase K.
6. Spin ned i 5 min ved 10.000 x g. Præparatet opbevares ved 4 °C for yderligere PCR-analyse.
Brug den samme metode til at forberede gDNA fra en nos-Cas9 flyve, der fungerer som en negativ kontrol. Udfør tretrins PCR-baserede skærme for at identificere den korrekte HDR(Figur 1, Figur 3) ved hjælp af gDNA for hver F1-mand som skabelon⁵. Der anvendes 1 μL DNA-prep i følgende PCR-reaktionssystem: 10 μL 2x PCR Master Mix with Dye, 1 μL af hver primer (10 μM), 1 μL DNA-skabelon og 7 μL ddH₂O.
Som vist i figur 3Askal du udføre PCR ved hjælp af primere fwd1 og rev1 for at screene for indsættelsen eller udskiftningen; udføre PCR ved hjælp af fwd2- og rev2-primere for at kontrollere indsættelsen eller udskiftningen fra 3'-området udføre PCR ved hjælp af primere M13F og rev3 for at kontrollere "ends-in" HDR (Tabel 1C).
Hold fluelinjerne med den bekræftede ends-out HDR og etablere afbalancerede lagre fra F2-generationen. Outcross til balancer flyver igen for at fjerne utilsigtede mutationer på andre kromosomer.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

figure-results-1
Figur 1: En oversigt over arbejdsgangen for CRISPR/Cas9-medieret genomredigering for at generere et binært transskriberingssystem. Den omtrentlige varighed, der kræves for hvert trin, er angivet. Klik her for at se en større version af dette tal.