Screening for genomiske modifikationer: En metode til at identificere CRISPR-genererede mutanter i Drosophila

Overview

Denne video beskriver en screening metode til at identificere transgene Drosophila fluer, hvis genom blev ændret ved hjælp af CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 er et kraftfuldt genomredigeringsværktøj, der revolutionerede den måde, hvorpå forskere kan manipulere en organismes genom. I eksempelprotokollen vil vi se, hvordan vi identificerer CRISPR-genererede mutanter, hvor en indsættelse af en transaktiveringssekvens erstatter den første exon af det branchless (bnl) gen, hvilket skaber en bnl genspecifik driverlinje, bnl-LexA.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Du et al.,En effektiv strategi for generering af vævsspecifikke binære transskriptionssystemer i Drosophila ved genomredigering, J. Vis. Exp. (2018).

1. Flyvegenetik og screening (figur 1 og figur 2)

1. Når de injicerede embryoner udvikler sig til voksne, krydser hver enkelt G₀ fluer til balancer fluer. Vælg passende balancer til kromosomet, der indeholder den målrettede allel.
2. Bedøve F1 afkom fra hver G0 tværs på en CO₂ pad og tilfældigt vælge 10-20 mænd under et stereomikroskop. Kryds dem individuelt til balancerhunnerne som vist i figur 2.
3. Når F2 larverne klækkes, skal du vælge den enkelte F1-far fra hvert kryds og udtrække gDNA ved hjælp af den enkelte flyve genomiske DNA-forberedelsesprotokol:
   1. Forbered gDNA ekstraktionsbuffer: 10 mM Tris-Cl pH 8.2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl, opbevar ved stuetemperatur. Forbered 20 mg/mL Proteinase K lageropløsning og opbevares i fryseren.
   2. Sæt hver flue i et 1,5 mL mikrocentrifugerør og mærk røret. I fryseren på -80 °C natten over.
   3. Der fremstilles et nyt arbejdsvolumen af gDNA-ekstraktionsbuffer, der indeholder 200 μg/mL endelig koncentration af Proteinase K.
      Bemærk: Brug ikke en gammel buffer til dette trin.
   4. Squish hver flyve i 10-15 s med en pipette spids indeholder 50 μL squishing buffer uden at dispensere væsken. Dispenser den resterende buffer i røret og bland godt. Inkuber ved 37 °C i 20-30 min.
   5. Sæt rør i 95 °C varmeblok i 1-2 minutter for at inaktivere Proteinase K.
   6. Spin ned i 5 min ved 10.000 x g. Præparatet opbevares ved 4 °C for yderligere PCR-analyse.
4. Brug den samme metode til at forberede gDNA fra en nos-Cas9 flyve, der fungerer som en negativ kontrol. Udfør tretrins PCR-baserede skærme for at identificere den korrekte HDR(Figur 1, Figur 3) ved hjælp af gDNA for hver F1-mand som skabelon⁵. Der anvendes 1 μL DNA-prep i følgende PCR-reaktionssystem: 10 μL 2x PCR Master Mix with Dye, 1 μL af hver primer (10 μM), 1 μL DNA-skabelon og 7 μL ddH₂O.
5. Som vist i figur 3Askal du udføre PCR ved hjælp af primere fwd1 og rev1 for at screene for indsættelsen eller udskiftningen; udføre PCR ved hjælp af fwd2- og rev2-primere for at kontrollere indsættelsen eller udskiftningen fra 3'-området udføre PCR ved hjælp af primere M13F og rev3 for at kontrollere "ends-in" HDR (Tabel 1C).
6. Hold fluelinjerne med den bekræftede ends-out HDR og etablere afbalancerede lagre fra F2-generationen. Outcross til balancer flyver igen for at fjerne utilsigtede mutationer på andre kromosomer.

Representative Results

Figur 1: En oversigt over arbejdsgangen for CRISPR/Cas9-medieret genomredigering for at generere et binært transskriberingssystem. Den omtrentlige varighed, der kræves for hvert trin, er angivet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: En illustration af CRISPR-screeningen og den genetiske krydsordning for etablering af genomredigerede flyvelinjer. I genetiske kryds står R for den redigerede allel, der er på 3 rd-kromosomet. MKRS (Tp(3;3)MRS, M(3)76A[1] kar[1] ry[2] Sb[1]), er en 3^rd kromosommarkør; TM6B (In(3LR)TM6B, Antp[Hu] e[1] Tb[1]) er en 3 rd-kromosombalancer. Genomredigerede fluelagre verificeres af PCR, der forstærker målregionerne af interesse fra det genomiske DNA, der er udvundet af enten F2- eller F3-generationens fluer og sekvens, der bestemmer PCR-produkterne. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Generering af bnl-LexA ved CRISPR/Cas9-medieret exon-udskiftning. (A) Skematisk tegning, der skildrer CRISPR/Cas9's strategi for medieret HDR til exon-udskiftning i bnl-locus. Æske - exon; line-intron; erstatningsdonor (pDonor-bnl:LexA) og to mulige resultater af HDR blev vist. Sekvensen pDonor-bnl:LexA havde følgende funktioner: (1) T2A-nls-LexA:p65 (~1.8kb) sekvens flankeret af 2 kb og 1,8 kb lange homologiarme (stiplede linjer), (2) en T2A selvkløvende peptid mellem den resterende N terminal bnl exon og nls-LexA:p65, og (3) en oversættelse stop codon (rød *) efter nls-LexA:p65 sekvens. HDR-produktet bevarede al transskriptionel og posttransskriptionel kontrol af bnl, og LexA:p65-proteinet forventes at blive produceret i samme mønster som endogene Bnl. Små sorte pile viser de relative bindende steder (ikke i skala) af PCR-primerne (Tabel 1), der bruges til 3-trins screening eller RT-PCR-validering. (B) Agarose gel billeder, der viser resultaterne af 3-trins PCR screening. PCR-produkter, der forstærkes fra det genomiske DNA fra fire succesfulde HDR-linjer, der ender ud, vises; negativ kontrol, det genomiske DNA i nos-Cas9 forældrelinje; positiv kontrol, pDonor-bnl:LexA plasmid; M, Marker (SL2K DNA stigen). (C) Et eksempel på screeningsgelen, der viser det forventede PCR-produkt ved hjælp af primere M13F og rev3 for ends-in-linjer. M8-7 og M9-6 er to ender-in linjer; negative og positive kontroller, det samme som i B M, Marker (NEB 1 kb DNA stigen). (D) RT-PCR-analyse af det samlede RNA fra bnl-LexA og nos-Cas9-kontrolfluerne. Forward primer binder sig til en LexA specifik region, omvendt primer binder sig til en downstream bnl exon region; ~ 440 bp (base-pair) forstærkning band (*) blev opdaget fra RT-PCR på bnl-LexAmRNA, men ikke fra kontrol RNA. M, 100 bp Marker (NEB). Tilpasset fra figur 2 og S1 i Du et al. 2017. Klik her for at se en større version af dette tal.

A. GRNA-kloning og sekventering
bnl-lexA gRNA fwd	TATATAGGAAAGATATCCGGGTGAACTTCGTGTATCTGCGAT
	GCCCCTCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
bnl-lexA gRNA rev	1984, s. 1973, s. 1773, PRÆMIS 23, OG AF 12.12.1989, SENEST A3-2001, SML. 1979, S. 1773, PRÆMIS 23.
	ATcGACGTTAAATTGAAAATAGGTC
T3 primer, der anvendes til sekventering	CAATTA ACCCTCACTAAAGG-3'
BEMÆRK: nukleotider understreget anneal til U6 initiativtager eller gRNA kerne på pCFD4 vektor, de små bogstaver g / c blev tilføjet til støtte U6 initiativtager-afhængige transskription
B. Konstruktion af HDR-donorer
bnl N-F_pUC19	AATTCGAGCTCGGTACtgtggttttgaggctggaac
bnl-lexA-N-R	1984, s. 1333, præmis 23, og af 12.12.1989, nr. GCCCGCAGATACAAGGCC
LexA-F	CTactGacttgCGGAtGGGAaGAACCCtGGC CCtATGCCACCCAAGAAGAAGC
LexA-R	CTAAACGAGTTTTTAAGCAAACTCACTC
bnl lexA-C Fwd	1984, S. 1773, 1775(1975)
bnl C-R_pUC19	GCCAAGCTTGCATGCCttcgcattgccgcctgg
BEMÆRK: nukleotider i kapital overlapning med pUC19 vektor for Gibson Assembly, nukleotider understreget var sekvens udhæng for T2A peptid tilføjelse.
C. HDR-screening og sekventering
bnl-lexA scr fwd1	GTGGCGCACGCCCAATAAAC
bnl-lexA scr rev1	GATCCCAGCCAATCTCCGTTG
bnl-lexA scr fwd2	CAACGGAGATTGGCTGGGATC
bnl-lexA scr rev2	CTGGCCAACTGTAGGGAAGTC
slutter-in check rev3	GCAATGTTATGCAATGCGTTGAC
bnl-lexA seq fwd3	CACTTGTCGCCCATATTGATACAATTG
BEMÆRK: Disse primere blev brugt til PCR screening og sekventering, den omtrentlige placering af primer bindende steder er vist i figur 5A som fwd1-2 og rev1-3.
D. RT-PCR-analyse
RT-f	GATATGGATTTCTCCGCTTTTGCTG
21,0 0 0 0 0	CCATGCAGAGATACAGGCAAGTG

Tabel 1: Primere, der anvendes i denne undersøgelse. (A) Primere til kloning af gRNA-ekspressionsvektor og sekventering. (B) Primere til kloning af HDR-donorskabelon. (C) Primere til screening og sekventering af HDR-produkterne. (D) Primere, der anvendes til RT-PCR-verifikation af det kimære LexA-bnl mRNA-produkt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T3253	Molecular Biology
EDTA	Sigma Aldrich	E1161	Molecular Biology
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Molecular Biology
UltraPure DNase/RNase-Free Water	ThermoFisher Scientific	10977-023	Molecular Biology
Primers	IDT-DNA		PCR
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	25530049	Molecular Biology
2x PCR PreMix, with dye (red)	Sydlab	MB067-EQ2R	Molecular Biology
MKRS/TB6B	Kornberg lab		Fly line
CO2 station	Genesee Scientific	59-122WCU	fly pushing
Stereo microscope	Olympus	SZ-61	fly pushing
Microtube homogenizing pestles	Fisher-Scientific	03-421-217	genomic DNA isolation