Screening för genomiska modifieringar: En metod för att identifiera CRISPR-genererade mutanter i Drosophila

In This Article

Abstract

Källa: Du, L., et al. En effektiv strategi för att generera vävnadsspecifika binära transkriptionssystem i Drosophila genom genomredigering. J. Vis. Exp. (2018).

Denna video beskriver en screeningmetod för att identifiera transgena Drosophila flugor, vars genom ändrades med CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 är ett kraftfullt genomredigeringsverktyg som revolutionerade hur forskare kan manipulera en organisms genom. I exempelprotokollet kommer vi att se hur man identifierar CRISPR-genererade mutanter, där en insättning av en transaktiveringssekvens ersätter den första exon av den branchless (bnl)genen, vilket skapar en bnl genspecifik förarlinje, bnl-LexA.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Du et al., En effektiv strategi för att generera vävnadsspecifika binära transkriptionssystem i Drosophila av Genome Editing, J. Vis. Exp. (2018).

1. Flyga genetik och screening (figur 1 och figur 2)

När de injicerade embryona utvecklas till vuxna, korsa varje G_{0 flugor} till balansflugor. Välj lämplig balanser för kromosomen som innehåller den riktade allelen.
Söv F1-avkomman från varje G0-kors på en CO_2-dyna och välj slumpmässigt 10-20 hanar under ett stereomikroskop. Korsa dem individuellt till balansörhonorna enligt figur 2.
När F2-larverna kläcks, välj den enda F1-fadern från varje kors och extrahera gDNA med hjälp av det enda fluggenomiska DNA-förberedelseprotokollet:
1. Förbered gDNA extraktionsbuffert: 10 mM Tris-Cl pH 8,2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl, förvara vid rumstemperatur. Förbered 20 mg/ml Proteinase K lagerlösning och förvara i frysen.
2. Sätt varje fluga i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och märk röret. Förvara frysen på -80 °C över natten.
3. Förbered en ny arbetsvolym av gDNA-extraktionsbuffert som innehåller 200 μg/ml slutlig koncentration av Proteinas K.
  Använd inte en gammal buffert för det här steget.
4. Krossa varje fluga i 10–15 s med en pipettspets som innehåller 50 μL squishing buffert utan att dosera vätskan. Dispensera den återstående bufferten i röret och blanda väl. Inkubera vid 37 °C i 20–30 min.
5. Sätt rör i 95 °C värmeblock i 1-2 min för att inaktivera Proteinas K.
6. Snurra ner i 5 min vid 10 000 x g. Förvara preparatet vid 4 °C för ytterligare PCR-analys.
Använd samma metod för att förbereda gDNA från en nos-Cas9-fluga, som fungerar som en negativ kontroll. Utför trestegs PCR-baserade skärmar för att identifiera rätt "slutar ut" HDR (Bild 1, Bild 3) med gDNA för varje F1-hane som mall⁵. Använd 1 μL AV DNA-prepen i följande PCR-reaktionssystem: 10 μL 2x PCR Master Mix med färgämne, 1 μL av varje primer (10 μM), 1 μL DNA-mall och 7 μL ddH₂O.
Som visas i figur 3A,utför PCR med primers fwd1 och rev1 för att screena för att det ska finnas införandet eller utbytet. utföra PCR med fwd2- och rev2-primers för att verifiera införandet eller utbytet från 3"-regionen, utföra PCR med primers M13F och rev3 för att kontrollera "ends-in" HDR(Tabell 1C).
Håll fluglinjerna med den bekräftade slututjämn HDR och etablera balanserade lager från F2-generationen. Outcross till balansören flyger igen för att ta bort oavsiktliga mutationer på andra kromosomer.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

figure-results-1
Bild 1: En översikt över arbetsflödet för CRISPR/Cas9-medierad genomredigering för att generera ett binärt transkriptionssystem. Den ungefärliga tidslängd som krävs för varje steg anges. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.