Screening för genomiska modifieringar: En metod för att identifiera CRISPR-genererade mutanter i Drosophila

Overview

Denna video beskriver en screeningmetod för att identifiera transgena Drosophila flugor, vars genom ändrades med CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 är ett kraftfullt genomredigeringsverktyg som revolutionerade hur forskare kan manipulera en organisms genom. I exempelprotokollet kommer vi att se hur man identifierar CRISPR-genererade mutanter, där en insättning av en transaktiveringssekvens ersätter den första exon av den branchless (bnl)genen, vilket skapar en bnl genspecifik förarlinje, bnl-LexA.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Du et al., En effektiv strategi för att generera vävnadsspecifika binära transkriptionssystem i Drosophila av Genome Editing, J. Vis. Exp. (2018).

1. Flyga genetik och screening (figur 1 och figur 2)

1. När de injicerade embryona utvecklas till vuxna, korsa varje G_{0 flugor} till balansflugor. Välj lämplig balanser för kromosomen som innehåller den riktade allelen.
2. Söv F1-avkomman från varje G0-kors på en CO_2-dyna och välj slumpmässigt 10-20 hanar under ett stereomikroskop. Korsa dem individuellt till balansörhonorna enligt figur 2.
3. När F2-larverna kläcks, välj den enda F1-fadern från varje kors och extrahera gDNA med hjälp av det enda fluggenomiska DNA-förberedelseprotokollet:
   1. Förbered gDNA extraktionsbuffert: 10 mM Tris-Cl pH 8,2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl, förvara vid rumstemperatur. Förbered 20 mg/ml Proteinase K lagerlösning och förvara i frysen.
   2. Sätt varje fluga i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och märk röret. Förvara frysen på -80 °C över natten.
   3. Förbered en ny arbetsvolym av gDNA-extraktionsbuffert som innehåller 200 μg/ml slutlig koncentration av Proteinas K.
      Använd inte en gammal buffert för det här steget.
   4. Krossa varje fluga i 10–15 s med en pipettspets som innehåller 50 μL squishing buffert utan att dosera vätskan. Dispensera den återstående bufferten i röret och blanda väl. Inkubera vid 37 °C i 20–30 min.
   5. Sätt rör i 95 °C värmeblock i 1-2 min för att inaktivera Proteinas K.
   6. Snurra ner i 5 min vid 10 000 x g. Förvara preparatet vid 4 °C för ytterligare PCR-analys.
4. Använd samma metod för att förbereda gDNA från en nos-Cas9-fluga, som fungerar som en negativ kontroll. Utför trestegs PCR-baserade skärmar för att identifiera rätt "slutar ut" HDR (Bild 1, Bild 3) med gDNA för varje F1-hane som mall⁵. Använd 1 μL AV DNA-prepen i följande PCR-reaktionssystem: 10 μL 2x PCR Master Mix med färgämne, 1 μL av varje primer (10 μM), 1 μL DNA-mall och 7 μL ddH₂O.
5. Som visas i figur 3A,utför PCR med primers fwd1 och rev1 för att screena för att det ska finnas införandet eller utbytet. utföra PCR med fwd2- och rev2-primers för att verifiera införandet eller utbytet från 3"-regionen, utföra PCR med primers M13F och rev3 för att kontrollera "ends-in" HDR(Tabell 1C).
6. Håll fluglinjerna med den bekräftade slututjämn HDR och etablera balanserade lager från F2-generationen. Outcross till balansören flyger igen för att ta bort oavsiktliga mutationer på andra kromosomer.

Representative Results

Bild 1: En översikt över arbetsflödet för CRISPR/Cas9-medierad genomredigering för att generera ett binärt transkriptionssystem. Den ungefärliga tidslängd som krävs för varje steg anges. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 2: En illustration av CRISPR-screeningen och det genetiska korsschemat för att upprätta genomreigerade fluglinjer. I genetiska kors står R för den redigerade allelen som finns på 3 rd-kromosomen. MKRS (Tp(3;3)MRS, M(3)76A[1] kar[1] ry[2] Sb[1]), är en kromosommarkör på 3^rd. TM6B (In(3LR)TM6B, Antp[Hu] e[1] Tb[1]) är en kromosombalanser på 3^rd. Genomreigerade fluglager verifieras genom pcr-förstärkning av målregioner av intresse från det genomiska DNA som extraheras från antingen F2- eller F3-generationens flugor och sekvens som bestämmer PCR-produkterna. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 3: Generation av bnl-LexA av CRISPR/Cas9-medierad exonersättning. A) Schematisk ritning som visar strategin för CRISPR/Cas9 medierad HDR för exon ersättning i bnl locus. Låda - exon; linje- intron; ersättningsdonator (pDonor-bnl:LexA)och två möjliga resultat av HDR visades. PDonor-bnl:LexA hade följande funktioner: (1) T2A-nls-LexA:p65 (~1.8kb) sekvens flankerad av 2 kb och 1,8 kb långa homologiarmar (streckade linjer ), (2) en T2A självklyvande peptid mellan den återstående N-terminalen bnl exon och nls-LexA:p65, och (3) en översättningsstoppkodon (röd *) efter nls-LexA:p65-sekvensen. HDR-produkten behöll all transkriptionell och post-transkriptionell kontroll av bnl, och LexA:p65-proteinet förväntas produceras i samma mönster som endogen Bnl. Små svarta pilar visar de relativa bindningsplatserna (inte i skala) för PCR-primers (tabell 1) som används för 3-stegs screening eller RT-PCR-validering. B) Agarose gel bilder som visar resultaten av 3-steg PCR screening. PCR-produkter som förstärks från genomiskt DNA från fyra framgångsrika slut-out HDR-linjer visas; negativ kontroll, nos-Cas9 föräldralinjesgenomiska DNA; positiv kontroll, pDonor-bnl:LexA plasmid; M, Markör (SL2K DNA-stege). c) Ett exempel på den siktgel som visar den förväntade PCR-produkten med primers M13F och rev3 för slutreplinter. M8-7 och M9-6 är två slutlinjer; Negativa och positiva kontroller, samma som i B. M, Markör (NEB 1 kb DNA-stege). D) RT-PCR-analys av totalt RNA från bnl-LexA och nos-Cas9-kontrollen flyger. Framåt primer binder till en LexA-specifik region, omvänd primer binder till en nedströms bnl exon region; ~440 bp (base-pair) förstärkningsband (*) upptäcktes från RT-PCR på bnl-LexAmRNA, men inte från kontroll-RNA. M, 100 bp markör (NEB). Anpassad från figurerna 2 och S1 i Du et al. 2017. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

A. gRNA-kloning och sekvensering
bnl-lexA gRNA fwd	TATATAGGAAAGATATCCGGGTGAACTTCGTGTATCTGCGAT
	GCCCCTCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
bnl-lexA gRNA rev	ATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTAAACTCCCGCAATCTGAAGG
	ATcGACGTTAAATTGAAAATAGGTC
T3 primer används för sekvensering	CAATTA ACCCTCACTAAAAGG-3'
OBS: Nukleotider understrukna glödg till U6 promotor eller gRNA kärna på pCFD4 vektor, gemener g/c lades till för att hjälpa U6 promotor-beroende transkription
B. HDR-givarkonstruktion
bnl N-F_pUC19	AATTCGAGCTCGGTACtgtggtctttgaggctggaac
bnl-lexA-N-R	tCCGcaagtCagtAGgctgccgcgtccttcgccgga GCCCGCAGATACAAGGCCCC (INTERNATIONELLA GCCCGCAGATACAAGGCCCC)
lexA-F	CTactGacttgCGGaGAtGTcGAaGAGAACCCtGGC CCtatGCCACCCAAGAAGAAGC
lexA-R	CTAAACGAGTTTTTAAGCAAACTCACTC
bnl lexA-C Fwd	TAAAAACTCGTTTAGACGGGATGGCGTTGTCAAC
bnl C-R_pUC19	GCCAAGCTTGCATGCCtcgcataattgccgcctgg
OBS: nukleotider i kapital överlappar pUC19 vektor för Gibson Assembly, nukleotider understrukna var sekvens överhäng för T2A peptid tillägg.
C. HDR-screening och sekvensering
bnl-lexA scr fwd1	GTGGCGCACGCCCAATAAAC (GTGGCGCAC)
bnl-lexA scr rev1	GATCCCAGCCAATCTCCGTTG
bnl-lexA scr fwd2	CAACGGAGATTGGCTGGGATC (CAACGGAGATTGGGGGATC)
bnl-lexA scr rev2	CTGGCCAACTGTAGGGAAGTC (CTGGCCAACTGTAGGGAAGTC)
incheckning rev3	GCAATGTTATGCAATGCGTTGAC (olika betydelser)
bnl-lexA seq fwd3	CACTTGTCGCCCATATTGATACAATTG
OBS: Dessa primers användes för PCR-screening och sekvensering, de ungefärliga platserna för primerbindningsplatser visas i figur 5A som fwd1-2 och rev1-3.
D. RT-PCR-analys
RT-f	GATATGGATTTCTCCGCTTTGCTG
RT-r	CCATGCAGAGATACAGGCAAGTG (OLIKA)

Tabell 1: Primers som används i denna studie. (A) Primers för kloning av gRNA uttryck vektor och sekvensering. (B) Primers för kloning HDR donator mall. C)Primers för screening och sekvensering av HDR-produkterna. D)Primers som används för RT-PCR-verifiering av den chimeriska LexA-bnl mRNA-produkten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T3253	Molecular Biology
EDTA	Sigma Aldrich	E1161	Molecular Biology
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Molecular Biology
UltraPure DNase/RNase-Free Water	ThermoFisher Scientific	10977-023	Molecular Biology
Primers	IDT-DNA		PCR
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	25530049	Molecular Biology
2x PCR PreMix, with dye (red)	Sydlab	MB067-EQ2R	Molecular Biology
MKRS/TB6B	Kornberg lab		Fly line
CO2 station	Genesee Scientific	59-122WCU	fly pushing
Stereo microscope	Olympus	SZ-61	fly pushing
Microtube homogenizing pestles	Fisher-Scientific	03-421-217	genomic DNA isolation