التجفيف الكيميائي: إعداد العينة البيولوجية لمسح المجهر الإلكتروني (SEM)

Overview

المسح المجهري الإلكتروني (SEM) هو أداة قوية للصورة - في المقام الأول - السمات السطحية لعينة بيولوجية. ومع ذلك، فإن إعداد العينة بشكل صحيح أمر بالغ الأهمية للحصول على صور ذات جودة عالية. يركز هذا الفيديو على خطوات الجفاف والتجفيف لإعداد Drosophila البالغة السليمة ل SEM.

Protocol

هذا البروتوكول هو مقتطف من كون وآخرون، إعداد الكائنات الحية Prokaryotic و Eukaryotic باستخدام التجفيف الكيميائي للتحليل المورفولوجي في المسح المجهري الإلكتروني (SEM) ، J. Vis. Exp. (2019).

1. الإعداد والتثبيت

1. إعداد Drosophila الميلانوغاستر (ذبابة الفاكهة).
   1. تخدير الذباب البالغ باستخدام ثاني أكسيد الكربون بنسبة 100٪. ضع البالغين المخدرين (حوالي 10 إلى 30 ذبابة) في قارورة غطاء مسمار بلاستيكي صغير أو أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل.
   2. تزج الذباب مخدر في 1 مل من المثبتة (1.25٪ غلوتارالدهيد، 0.1 M الفوسفات العازلة درجة الحموضة 7.2) لمدة 2 ساعة (أو بين عشية وضحاها) في 4 درجة مئوية. إذا كان الذباب يطفو على سطح المثبت، إضافة بضع قطرات من 2.5٪ البولي ايثيلين غليكول tert-octylphenyl الأثير لإضعاف التوتر السطحي للمثبت السماح للغمر الكلي للأنسجة. قم بإزالة المثبت باستخدام أنبوب زجاجي.

2. الغسيل والجفاف

1. غسل وتجفيف Drosophila الميلانوغاستر (ذبابة الفاكهة).
   1. اغسل العينة الثابتة ثلاث مرات مع 1 مل من 0.1 M الفوسفات العازلة درجة الحموضة 7.2 في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل. إزالة كل غسل مع ماصة زجاجية، مع الحرص على عدم إزالة الذباب.
   2. تجفيف العينة باستخدام سلسلة الإيثانول متدرج، لمدة 10 دقيقة في حجم 1 مل في أنبوب ميكروفوج. تركيزات الإيثانول هي: 25٪، 50٪، 75٪، 80٪، 95٪، 100٪. إزالة الإيثانول مع ماصة زجاجية، مع الحرص على عدم إزالة الذباب.
   3. احتفظ بالعينة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل مع ما يكفي من الإيثانول بنسبة 100٪ لتغطية العينة قبل التجفيف.

3. التجفيف

1. إجراء التجفيف الكيميائي باستخدام الهيكساميثيليدسيلازان (HMDS).
   1. استبدل محلول الإيثانول بنسبة 100٪ بمحلول 1:2 من HMDS والإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 20 دقيقة. استبدال الحل 1:2 مع حل 2:1 من HMDS والإيثانول 100٪ لمدة 20 دقيقة. استبدال الحل 2:1 مع HMDS 100٪ لمدة 20 دقيقة كرر مرة واحدة.
      ملاحظة: HMDS قابل للاشتعال وسم حاد (مسار الجلد). يجب التعامل مع HMDS في غطاء الدخان الكيميائي باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة بما في ذلك القفازات ومعطف المختبر وحماية العين.
   2. نقل العينة في HMDS، إذا كان في أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل، إلى طبق وزن الألومنيوم المتاح. مرة واحدة في طبق وزن الألومنيوم، واستبدال HMDS 100٪ مع ما يكفي فقط من HMDS الطازجة 100٪ لتغطية العينة.
   3. نقل العينة إلى البلاستيك أو الزجاج غير فراغ المجفف مع المجفف الطازج (5-6 سم عميق) ووضعها في غطاء الدخان الكيميائي. بدلا من ذلك، ضع العينة مباشرة في غطاء أبخرة كيميائي لتجف بغطاء فضفاض، مثل الصندوق، لمنع الحطام من السقوط على العينة. السماح للعينة لتجف لمدة 12 إلى 24 ساعة.

4. تصاعد

1. جبل دروسوفيلا ميلانوغاستر (ذبابة الفاكهة).
   1. تسمية الجزء السفلي من كعب الألومنيوم تصاعد للإشارة إلى ما يتم وضعه على القمة.
      ضع الذباب المجفف في الموضع المطلوب على علامة تبويب لاصقة أو لاصقة كربونية مؤمنة إلى أعلى كعب تحت مجهر تشريح مع ملاقط دقيقة.
   2. تطبيق الفضة لاصق موصل، أي،والطلاء الفضي، حول الحواف الخارجية للكعوب. قم بتوصيل الطلاء الفضي بالذباب باستخدام مسواك لضمان الموصلية. لا تسمح للطلاء بلمس منطقة التصوير المطلوبة.
   3. ضع كعب الروتين في صندوق حامل كعب الروتين وضع مربع حامل كعب الروتين المفتوح في مجفف. السماح للطلاء الفضة لتجف على الأقل 3 ساعة أو بين عشية وضحاها للحصول على أفضل النتائج.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silver conductive adhesive 503	Electron Microscopy Sciences	12686-15
aluminum weighing dish	Fisher Scientific	08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm)	Electron Microscopy Sciences	75210
aluminum mounting stubs (25 mm)	Electron Microscopy Sciences	75186
Adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	76760
conductive carbon adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	77825
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)	VWR	97062-208
Hitachi 3400N-II SEM	Hitachi	https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/	The company doesn't appear to sell this model any longer