化学干燥：扫描电子显微镜（SEM）的生物样品制备

扫描电子显微镜（SEM）是一种强大的图像工具——主要是——生物样本的表面特征。然而，适当的样品准备对于获得高质量的图像至关重要。此视频侧重于为 SEM 准备完好无损的成人 德罗索菲拉 的脱水和干燥步骤。

本协议摘自Koon等人的摘录，即利用化学干燥进行扫描电子显微镜（SEM）、J.Vis.Exp.（2019年）的真核生物和真核生物的制备。

1. 准备和固定

准备 德罗索菲拉梅拉诺加斯特 （果蝇）。
1. 用100%的二氧化碳麻醉成年苍蝇。将麻醉成人（约10至30只苍蝇）放在小塑料螺丝帽小瓶或1.5mL离心机管中。
2. 将麻醉苍蝇浸入 1 mL 的固定性（1.25% 谷氨酸、0.1 M 磷酸盐缓冲液 pH 7.2）中，在 4 °C 下 2 小时（或过夜）。如果苍蝇漂浮到固定物的表面，加入几滴2.5%的聚乙二醇二乙酰乙醚，以削弱固定物的表面张力，从而完全淹没组织。使用玻璃管道去除固定剂。

2. 洗涤和脱水

洗净和脱水 的德罗索菲拉梅拉诺加斯特 （果蝇）。
1. 用 1 mL 的 0.1 M 磷酸盐缓冲 pH 7.2 在室温下用 1.5 mL 微中量管清洗固定样品三次，10 分钟。用玻璃移液器取出每个洗涤液，小心不要移除苍蝇。
2. 使用分级乙醇系列使样品脱水，在微燃料管中以 1 mL 的体积脱水 10 分钟。乙醇浓度分别为：25%、50%、75%、80%、95%、100%。用玻璃移液器去除乙醇，小心不要去除苍蝇。
3. 将样品保留在 1.5 mL 微中燃料管中，并有足够的 100% 乙醇在干燥前覆盖样品。

3. 干燥

使用六甲基迪西拉赞（HMDS）进行化学干燥。
1. 用 1：2 的 HMDS 溶液和 100% 乙醇代替 100% 乙醇溶液 20 分钟。用 2：1 的 HMDS 和 100% 乙醇溶液替换 1：2 溶液 20 分钟。用 100% HMDS 替换 2：1 解决方案 20 分钟。重复一次。
  注意：HMDS 是易燃和急性毒素（皮肤路线）。HMDS 应使用适当的个人防护设备（包括手套、实验室外套和眼睛保护）在化学烟雾罩中处理。
2. 将 HMDS 中的样品（如果在 1.5 mL 微中心管中）中转移到一次性铝称重盘中。一旦进入铝制称重盘，只需用足够的新鲜 100% HMDS 替换 100% HMDS 以覆盖样品。
3. 将样品转移到带有新鲜干燥剂（5-6厘米深）的塑料或玻璃非真空干燥器中，放入化学烟雾罩中。或者，将样品直接放在化学烟雾罩中，用松动的盖子（如盒子）干燥，以防止碎屑落在样品上。让样品干燥12至24小时。

4. 安装

德罗索菲拉山梅拉诺加斯特（果蝇）。
1. 标记铝安装存根的底部，以指示顶部放置的内容。
  将干苍蝇置于所需的位置，粘合剂或碳粘合剂标签用精密钳子固定在根架顶部。
2. 在存根的外缘涂上导银胶粘剂，即银漆。使用牙签将银漆与苍蝇连接起来，以确保电导率。不允许油漆接触所需的成像区域。
3. 将存根放在存根支架盒中，并将打开的存根支架盒放在干燥器中。让银漆干燥至少3小时或过夜，以获得最佳效果。

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Name	Company	Catalog Number	Comments
Silver conductive adhesive 503	Electron Microscopy Sciences	12686-15
aluminum weighing dish	Fisher Scientific	08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm)	Electron Microscopy Sciences	75210
aluminum mounting stubs (25 mm)	Electron Microscopy Sciences	75186
Adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	76760
conductive carbon adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	77825
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)	VWR	97062-208
Hitachi 3400N-II SEM	Hitachi	https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/	The company doesn't appear to sell this model any longer