Kemisk tørring: Biologisk prøvepræparat til scanning af elektronmikroskopi (SEM)

Overview

Scanning af elektronmikroskopi (SEM) er et effektivt værktøj til at afbilde – primært – overfladefunktionerne i en biologisk prøve. Korrekt prøveforberedelse er imidlertid afgørende for at opnå kvalitetsbilleder. Denne video fokuserer på dehydrering og tørring trin for at forberede intakt voksen Drosophila til SEM.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Koon et al., Forberedelse af prokaryote og eukaryote organismer ved hjælp af kemisk tørring til morfologisk analyse i scanning af elektronmikroskopi (SEM), J. Vis. Exp. (2019).

1. Forberedelse og fiksering

1. Forbered Drosophila melanogaster (frugtflue).
   1. Bedøve voksne fluer ved hjælp af 100% kuldioxid. Placer bedøvede voksne (ca. 10 til 30 fluer) i et lille plastskruehætteglas eller 1,5 mL centrifugerør.
   2. Bedøvede fluer i 1 mL fiksativ (1,25% glutaraldehyd, 0,1 M fosfatbuffer pH 7,2) i 2 timer (eller natten over) ved 4 °C. Hvis fluerne flyder til overfladen af fikseringsstativet, tilsæt et par dråber af 2,5% polyethylen glycol tert-octylphenyl ether for at svække overfladespændingen af fikseringssættet, hvilket giver mulighed for total nedsænkning af vævet. Fjern fikseringsstativet ved hjælp af en glaspipet.

2. Vask og dehydrering

1. Vask og dehydrere Drosophila melanogaster (frugt flyve).
   1. Den faste prøve vaskes tre gange med 1 mL 0,1 M fosfatbuffer pH 7.2 ved stuetemperatur i 10 minutter i et mikrocentrifugerør på 1,5 mL. Fjern hver vask med en glaspipette, og pas på ikke at fjerne fluerne.
   2. Prøven dehydreres ved hjælp af en gradueret ethanolserie i 10 minutter i et volumen på 1 mL i et mikrofugerør. Ethanolkoncentrationerne er: 25%, 50%, 75%, 80%, 95%, 100%. Fjern ethanolen med en glaspipette, og pas på ikke at fjerne fluerne.
   3. Prøven opbevares i mikrocentrifugerøret på 1,5 mL med lige nok 100% ethanol til at dække prøven inden tørring.

3. Tørring

1. Udfør kemisk tørring ved hjælp af hexamethyldisilazane (HMDS).
   1. Udskift 100% ethanolopløsningen med en 1:2 opløsning af HMDS og 100% ethanol i 20 min. Udskift 1:2 opløsningen med en 2:1 opløsning af HMDS og 100% ethanol i 20 min. Udskift 2:1-opløsningen med 100% HMDS i 20 min. Gentag én gang.
      Bemærk: HMDS er brandfarligt og et akut toksin (dermal rute). HMDS skal håndteres i en kemisk røghætte ved hjælp af passende personlige værnemidler, herunder handsker, laboratoriekittel og øjenværn.
   2. Prøven overføres i HMDS, hvis den er i et mikrocentrifugerør på 1,5 mL, til en engangs aluminiumsvejningsskål. Når du er i aluminiumsvejningsskålen, skal du udskifte 100% HMDS med lige nok frisk 100% HMDS til at dække prøven.
   3. Prøven overføres til en ikke-vakuumdesikkator af plast eller glas med frisk desiccant (5-6 cm dyb) og anbringes i en kemisk røghætte. Alternativt kan prøven anbringes direkte i en kemisk røghætte for at tørre med et løst låg, f.eks. Lad prøven tørre i 12 til 24 timer.

4. Montering

1. Mount Drosophila melanogaster (frugtflue).
   1. Mærk bunden af aluminiumsmonteringsstubben for at angive, hvad der placeres på toppen.
      Placer de tørrede fluer i den ønskede position på klæbe- eller carbonklæbende fane fastgjort til toppen af en stub under et dissekerende mikroskop med præcisionstørklædere.
   2. Påfør sølv ledende klæbemiddel, dvssølv maling, omkring yderkanterne af stubbe. Tilslut sølvmaling til fluerne ved hjælp af en tandstikker for at sikre ledningsevne. Lad ikke malingen berøre det ønskede billedområde.
   3. Sæt stubberne i en stubholderboks, og placer den åbne stubholderboks i en ekssikkator. Lad sølvmalingen tørre mindst 3 timer eller natten over for at opnå de bedste resultater.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silver conductive adhesive 503	Electron Microscopy Sciences	12686-15
aluminum weighing dish	Fisher Scientific	08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm)	Electron Microscopy Sciences	75210
aluminum mounting stubs (25 mm)	Electron Microscopy Sciences	75186
Adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	76760
conductive carbon adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	77825
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)	VWR	97062-208
Hitachi 3400N-II SEM	Hitachi	https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/	The company doesn't appear to sell this model any longer