Denne protokol er et uddrag fra Koon et al., Forberedelse af prokaryote og eukaryote organismer ved hjælp af kemisk tørring til morfologisk analyse i scanning af elektronmikroskopi (SEM), J. Vis. Exp. (2019).
1. Forberedelse og fiksering
- Forbered Drosophila melanogaster (frugtflue).
- Bedøve voksne fluer ved hjælp af 100% kuldioxid. Placer bedøvede voksne (ca. 10 til 30 fluer) i et lille plastskruehætteglas eller 1,5 mL centrifugerør.
- Bedøvede fluer i 1 mL fiksativ (1,25% glutaraldehyd, 0,1 M fosfatbuffer pH 7,2) i 2 timer (eller natten over) ved 4 °C. Hvis fluerne flyder til overfladen af fikseringsstativet, tilsæt et par dråber af 2,5% polyethylen glycol tert-octylphenyl ether for at svække overfladespændingen af fikseringssættet, hvilket giver mulighed for total nedsænkning af vævet. Fjern fikseringsstativet ved hjælp af en glaspipet.
2. Vask og dehydrering
- Vask og dehydrere Drosophila melanogaster (frugt flyve).
- Den faste prøve vaskes tre gange med 1 mL 0,1 M fosfatbuffer pH 7.2 ved stuetemperatur i 10 minutter i et mikrocentrifugerør på 1,5 mL. Fjern hver vask med en glaspipette, og pas på ikke at fjerne fluerne.
- Prøven dehydreres ved hjælp af en gradueret ethanolserie i 10 minutter i et volumen på 1 mL i et mikrofugerør. Ethanolkoncentrationerne er: 25%, 50%, 75%, 80%, 95%, 100%. Fjern ethanolen med en glaspipette, og pas på ikke at fjerne fluerne.
- Prøven opbevares i mikrocentrifugerøret på 1,5 mL med lige nok 100% ethanol til at dække prøven inden tørring.
3. Tørring
- Udfør kemisk tørring ved hjælp af hexamethyldisilazane (HMDS).
- Udskift 100% ethanolopløsningen med en 1:2 opløsning af HMDS og 100% ethanol i 20 min. Udskift 1:2 opløsningen med en 2:1 opløsning af HMDS og 100% ethanol i 20 min. Udskift 2:1-opløsningen med 100% HMDS i 20 min. Gentag én gang.
Bemærk: HMDS er brandfarligt og et akut toksin (dermal rute). HMDS skal håndteres i en kemisk røghætte ved hjælp af passende personlige værnemidler, herunder handsker, laboratoriekittel og øjenværn.
- Prøven overføres i HMDS, hvis den er i et mikrocentrifugerør på 1,5 mL, til en engangs aluminiumsvejningsskål. Når du er i aluminiumsvejningsskålen, skal du udskifte 100% HMDS med lige nok frisk 100% HMDS til at dække prøven.
- Prøven overføres til en ikke-vakuumdesikkator af plast eller glas med frisk desiccant (5-6 cm dyb) og anbringes i en kemisk røghætte. Alternativt kan prøven anbringes direkte i en kemisk røghætte for at tørre med et løst låg, f.eks. Lad prøven tørre i 12 til 24 timer.
4. Montering
- Mount Drosophila melanogaster (frugtflue).
- Mærk bunden af aluminiumsmonteringsstubben for at angive, hvad der placeres på toppen.
Placer de tørrede fluer i den ønskede position på klæbe- eller carbonklæbende fane fastgjort til toppen af en stub under et dissekerende mikroskop med præcisionstørklædere.
- Påfør sølv ledende klæbemiddel, dvssølv maling, omkring yderkanterne af stubbe. Tilslut sølvmaling til fluerne ved hjælp af en tandstikker for at sikre ledningsevne. Lad ikke malingen berøre det ønskede billedområde.
- Sæt stubberne i en stubholderboks, og placer den åbne stubholderboks i en ekssikkator. Lad sølvmalingen tørre mindst 3 timer eller natten over for at opnå de bedste resultater.
