रासायनिक सुखाने: इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग के लिए जैविक नमूना तैयारी (SEM)

Overview

स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) छवि के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है- मुख्य रूप से- जैविक नमूने की सतह विशेषताएं। उचित नमूना तैयारी, हालांकि, गुणवत्ता छवियों को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह वीडियो एसईएम के लिए बरकरार वयस्क ड्रोसोफिला तैयार करने के निर्जलीकरण और सुखाने के कदमों पर केंद्रित है।

Protocol

यह प्रोटोकॉल कून एट अलसे एक अंश है, स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम), जे विस एक्सप्रेस (2019) में रूपात्मक विश्लेषण के लिए रासायनिक सुखाने का उपयोग करके प्रोकैरियोटिक और यूकेरियोटिक जीवों की तैयारी।

1. तैयारी और निर्धारण

1. ड्रोसोफिला मेलनोगास्टर (फ्रूट फ्लाई) तैयार करें।
   1. 100% कार्बन डाइऑक्साइड का उपयोग करके वयस्क मक्खियों को एनेस्थेटाइज करें। एक छोटे प्लास्टिक स्क्रू कैप शीशी या 1.5 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में एनेस्थेटाइज्ड वयस्कों (लगभग 10 से 30 मक्खियों) रखें।
   2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे (या रात भर) के लिए 1 मिलील में 1 मिली हुई आरसेट (1.25% ग्लूटाराल्डिहाइड, 0.1 एम फॉस्फेट बफर पीएच 7.2) में विसर्जित करें। यदि मक्खियां सुधारक की सतह पर तैरती हैं, तो ऊतक के कुल पनडुब्बी के लिए दोषात्मक की सतह तनाव को कमजोर करने के लिए 2.5% पॉलीथीन ग्लाइकोल टार्ट-ऑक्टिलफेनिल ईथर की कुछ बूंदें जोड़ें। एक ग्लास पिपेट का उपयोग करके फिक्सेटिव निकालें।

2. वाशिंग और निर्जलीकरण

1. ड्रोसोफिला मेलनोगास्टर (फल मक्खी) को धोएं और निर्जलित करें।
   1. 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 0.1 एम फॉस्फेट बफर पीएच 7.2 के 1 एमएल के साथ तीन बार तय नमूने को धोएं। मक्खियों को हटाने के लिए सावधान नहीं किया जा रहा है, एक गिलास पिपेट के साथ प्रत्येक धोने निकालें।
   2. एक माइक्रोफेज ट्यूब में 1 एमएल की मात्रा में 10 मिनट के लिए, एक ग्रेडेड इथेनॉल श्रृंखला का उपयोग करके नमूना निर्जलित करें। इथेनॉल सांद्रता हैं: 25%, 50%, 75%, 80%, 95%, 100%। एक ग्लास पिपेट के साथ इथेनॉल निकालें, मक्खियों को हटाने के लिए सावधान नहीं किया जा रहा है।
   3. 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में नमूने को सुखाने से पहले नमूने को कवर करने के लिए पर्याप्त 100% इथेनॉल के साथ बनाए रखें।

3. सुखाने

1. हेक्सामेथिलडिसिलेज़न (एचएमडीएस) का उपयोग करके रासायनिक सुखाने का कार्य करें।
   1. 100% इथेनॉल समाधान को एचएमडीएस के 1:2 समाधान और 20 मिनट के लिए 100% इथेनॉल के साथ बदलें। 1:2 समाधान को एचएमडीएस के 2:1 समाधान और 20 मिनट के लिए 100% इथेनॉल के साथ बदलें। 20 मिनट के लिए 100% एचएमडीएस के साथ 2:1 समाधान को बदलें। एक बार दोहराएं।
      नोट: एचएमडीएस ज्वलनशील और एक तीव्र विष (डर्मल मार्ग) है। एचएमडीएस को दस्ताने, प्रयोगशाला कोट और आंखों की सुरक्षा सहित उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों का उपयोग करके रासायनिक धुएं हुड में संभाला जाना चाहिए।
   2. एचएमडीएस में नमूना स्थानांतरित करें, यदि 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में, डिस्पोजेबल एल्यूमीनियम वजनी डिश में। एक बार एल्यूमीनियम वजनी डिश में, नमूने को कवर करने के लिए 100% एचएमडीएस को पर्याप्त ताजा 100% एचएमडीएस के साथ बदलें।
   3. नमूना को एक प्लास्टिक या ग्लास गैर-वैक्यूम डेसिकेटर में स्थानांतरित करें जिसमें ताजा डेसिकेंट (5-6 सेमी गहरा) होता है और रासायनिक धुएं हुड में जगह मिलती है। वैकल्पिक रूप से, नमूने पर गिरने से मलबे को रोकने के लिए, एक ढीले ढक्कन के साथ सूखने के लिए सीधे एक रासायनिक धुएं हुड में नमूना रखें, जैसे कि एक बॉक्स। नमूना 12 से 24 घंटे के लिए सूखने की अनुमति दें।

4. बढ़ते

1. माउंट ड्रोसोफिला मेलानोगैस्टर (फल मक्खी)।
   1. एल्यूमीनियम बढ़ते स्टब के नीचे लेबल इंगित करने के लिए क्या शीर्ष पर रखा जा रहा है ।
      सूखे मक्खियों को चिपकने वाले या कार्बन चिपकने वाले टैब पर वांछित स्थिति में रखें जो सटीक चिमटी के साथ विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत एक स्टब के शीर्ष पर सुरक्षित होते हैं।
   2. स्टब्स के बाहरी किनारों के आसपास सिल्वर कंडक्टिव चिपकने वाला यानीसिल्वर पेंट लगाएं। चालकता सुनिश्चित करने के लिए टूथपिक का उपयोग करके मक्खियों से चांदी के पेंट को कनेक्ट करें। पेंट वांछित इमेजिंग क्षेत्र को छूने की अनुमति न दें।
   3. स्टब होल्डर बॉक्स में ठूंठ रखें और खुले स्तूब होल्डर बॉक्स को एक डिसेकर में रखें। चांदी के पेंट को सर्वोत्तम परिणामों के लिए कम से कम 3 घंटे या रात भर सूखने दें।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silver conductive adhesive 503	Electron Microscopy Sciences	12686-15
aluminum weighing dish	Fisher Scientific	08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm)	Electron Microscopy Sciences	75210
aluminum mounting stubs (25 mm)	Electron Microscopy Sciences	75186
Adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	76760
conductive carbon adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	77825
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)	VWR	97062-208
Hitachi 3400N-II SEM	Hitachi	https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/	The company doesn't appear to sell this model any longer