化学乾燥:走査型電子顕微鏡(SEM)のための生物学的サンプル調製

Abstract

出典:Koon, M. A., et al. 走査型電子顕微鏡(SEM)における形態学的分析のための化学的乾燥を使用した原核生物および真核生物の調製。J. Vis. Exp.(2019年)。

走査型電子顕微鏡(SEM)は、主に生体試料の表面特性を画像化するための強力なツールです。ただし、高品質の画像を取得するには、適切なサンプル調製が重要です。このビデオでは、SEM用の無傷の成体ショウジョウバエを調製するための脱水および乾燥ステップに焦点を当てています。

Protocol

このプロトコルは、Koon et al., Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM), J. Vis. Exp. からの抜粋です。(2019年)。

1. 準備と固定

1. ショウジョウバエmelanogaster(ショウジョウバエ)を準備します。
   1. 100%二酸化炭素を使用して成虫のハエに麻酔をかけます。麻酔をかけた成虫(約10〜30匹のハエ)を小さなプラスチック製のスクリューキャップバイアルまたは1.5mLの遠心分離チューブに入れます。
   2. 麻酔をかけたハエを1 mLの固定剤(1.25%グルタルアルデヒド、0.1 Mリン酸緩衝液pH 7.2)に4°Cで2時間(または一晩)浸します。ハエが固定液の表面に浮かぶ場合は、2.5%ポリエチレングリコールtert-オクチルフェニルエーテルを数滴加えて、固定液の表面張力を弱め、組織を完全に沈めるようにします。ガラスピペットを使用して固定液を取り除きます。

2. 洗濯と脱水

1. Drosophila melanogaster(ショウジョウバエ)を洗って脱水します。
   1. 固定サンプルを1.5 mLの微量遠心チューブで、0.1 Mリン酸緩衝液(pH 7.2)1 mL、室温、10分間、3回洗浄します。フライを取り除かないように注意しながら、ガラスピペットで各洗浄液を取り外してください。
   2. 等級付けされたエタノールシリーズを使用して、マイクロフュージチューブ内で1mLの容量で10分間サンプルを脱水します。エタノール濃度は、25%、50%、75%、80%、95%、100%です。ハエを取らないように注意しながら、ガラスピペットでエタノールを取り出します。
   3. 乾燥する前に、サンプルを100%エタノールで覆うのに十分な量の1.5 mLマイクロ遠心チューブにサンプルを保持します。

3. 乾燥

1. ヘキサメチルジシラザン(HMDS)を用いて薬品乾燥を行います。
   1. 100%エタノール溶液をHMDSの1:2溶液と100%エタノール溶液に20分間交換します。1:2溶液をHMDSの2:1溶液と100%エタノール溶液に20分間交換します。20分間繰り返します。
      注:HMDSは可燃性で急性毒素(皮膚経路)です。HMDSは、手袋、白衣、目の保護具などの適切な個人用保護具を使用して、化学薬品のヒュームフードで取り扱う必要があります。
   2. HMDS内のサンプルを1.5 mLの微量遠心チューブに入れ、使い捨てのアルミニウム製計量皿に移します。アルミニウム計量皿に入ったら、100% HMDSをサンプルを覆うのに十分な新鮮な100% HMDSと交換します。
   3. サンプルを新鮮な乾燥剤(深さ5〜6 cm)を備えたプラスチックまたはガラスの非真空デシケーターに移し、化学ドラフトに入れます。あるいは、サンプルを直接化学ドラフトに入れて、箱などの蓋を緩めて乾燥させ、サンプルに破片が落ちるのを防ぎます。サンプルを12〜24時間乾燥させます。

4. 取り付け

1. ショウジョウバエ山(ショウジョウバエ)。
   1. アルミニウム取り付けスタブの下部にラベルを付けて、上部に何が配置されているかを示します。
      乾燥したハエを、精密ピンセットで解剖顕微鏡の下でスタブの上部に固定された接着剤またはカーボン接着剤タブ上の目的の位置に置きます。
   2. スタブの外縁の周りに銀の導電性接着剤、つまり銀の塗料を塗布します。つまようじを使用して銀色の塗料をハエに接続し、導電性を確保します。塗料が目的のイメージング領域に触れないようにしてください。
   3. スタブをスタブホルダーボックスに入れ、開いたスタブホルダーボックスをデシケーターに入れます。最良の結果を得るには、シルバーペイントを少なくとも3時間または一晩乾燥させます。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
銀導電性接着剤503	電子顕微鏡科学	12686-15
アルミ計量皿	フィッシャーサイエンティフィック	08-732-100
アルミニウム取り付けスタブ(12 mm)	電子顕微鏡科学	75210
アルミニウム製取り付けスタブ(25 mm)	電子顕微鏡科学	75186
粘着タブ	電子顕微鏡科学	76760
導電性カーボン粘着タブ	電子顕微鏡科学	77825
ポリエチレングリコールtert-オクチルフェニルエーテル(トリトンX-100)	VWRの	〒97062-208
日立 3400N-II SEM	日立	https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/	同社はこのモデルをもう販売していないようです

(代表)