化学乾燥:走査型電子顕微鏡(SEM)の生体試料調製

走査型電子顕微鏡(SEM)は、生物学的試料の表面特徴を主に画像化するための強力なツールです。ただし、適切なサンプル準備は、高品質の画像を得るために重要です。このビデオでは、SEMのために無傷の成人 ショウジョウバエ を準備する脱水と乾燥のステップに焦点を当てています。

このプロトコルは、クオンら、走査電子顕微鏡(SEM)、J. Vis. Exp. (2019) の形態素解析のための化学乾燥を用いた原核生物および真核生物の調製からの抜粋である。

1. 準備と固定

ショ ウジョウバエメラノガスター (フルーツフライ)を準備します。
1. 100%二酸化炭素を使用して、成体のハエを麻酔します。小さなプラスチック製のスクリューキャップバイアルまたは1.5 mL遠心分離チューブに麻酔付き大人(約10〜30ハエ)を入れる。
2. 麻酔付きハエを1 mLの固定剤(1.25%グルタルアルアルデヒド、0.1 Mリン酸緩衝液pH 7.2)に2時間(または一晩)4°Cで浸漬する。ハエが固定剤の表面に浮かぶ場合は、2.5%ポリエチレングリコールtert-オクチルフェニルエーテルの数滴を加え、固定剤の表面張力を弱め、組織の総浸水を可能にする。ガラスパイプを使用して固定剤を取り外します。

2. 洗濯・脱水

ショ ウジョウバエメラノガスター (フルーツフライ)を洗浄し、脱水します。
1. 固定サンプルを1.5 mLマイクロ遠心分離管で10分間室温で0.1Mリン酸緩衝液pH 7.2の1 mLで3回洗浄します。ハエを取り除かないように注意して、ガラスピペットで各洗浄を取り除きます。
2. グレードエタノールシリーズを用いてサンプルを脱水し、マイクロフュージチューブ内で1mLの体積で10分間乾燥させる。エタノール濃度は、25%、50%、75%、80%、95%、100%である。ハエを取り除かないように注意して、ガラスピペットでエタノールを取り除きます。
3. 乾燥前にサンプルをカバーするのに十分な100%エタノールで1.5 mLマイクロ遠心分離管にサンプルを保持します。

3. 乾燥

ヘキサメチルジシルラザン(HMDS)を用いて化学乾燥を行う。
1. 100%エタノール溶液をHMDSの1:2溶液と20分間の100%エタノールに交換してください。1:2溶液をHMDSの2:1溶液と20分間のエタノール100%に交換してください。2:1溶液を100%HMDSに20分間交換してください。
  注:HMDSは可燃性および急性毒素(真皮経路)である。HMDSは、手袋、ラボコート、眼保護などの適切な個人用保護具を使用して、化学発煙フードで取り扱う必要があります。
2. HMDSでサンプルを1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに入れていれば、使い捨てのアルミニウム計量皿に移します。アルミニウム計量皿に入ったら、サンプルをカバーするのに十分な新鮮な100%HMDSで100%HMDSを交換してください。
3. 新鮮な乾燥剤(深さ5〜6cm)のプラスチック製またはガラス製の非真空デシケータにサンプルを移し、化学煙のフードに入れます。あるいは、サンプルを化学発煙フードに直接入れて、箱などの緩い蓋で乾燥させ、破片がサンプルに落ちるのを防ぎます。サンプルを12〜24時間乾燥させます。

4. 取り付け

ショウジョウバエのメラノガスター山(フルーツフライ)。
1. アルミニウム取り付けスタブの底にラベルを付けて、上に配置されているものを示します。
  乾燥したハエを、精密ピンセットで解剖顕微鏡の下でスタブの上部に固定した接着剤またはカーボン接着剤タブの所望の位置に置きます。
2. 銀の導電性接着剤、 すなわち、銀の塗料を、スタブの外縁の周りに塗布します。導電性を確保するために爪楊枝を使用してハエに銀色の塗料を接続します。ペイントが目的のイメージング領域に触れないようにしてください。
3. スタブをスタブホルダーボックスに入れ、開いたスタブホルダーボックスをデシケータに入れます。最良の結果を得るために、銀色の塗料を少なくとも3時間または一晩乾燥させます。

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Name	Company	Catalog Number	Comments
Silver conductive adhesive 503	Electron Microscopy Sciences	12686-15
aluminum weighing dish	Fisher Scientific	08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm)	Electron Microscopy Sciences	75210
aluminum mounting stubs (25 mm)	Electron Microscopy Sciences	75186
Adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	76760
conductive carbon adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	77825
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)	VWR	97062-208
Hitachi 3400N-II SEM	Hitachi	https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/	The company doesn't appear to sell this model any longer