Химическая сушка: Биологическая подготовка образца для сканирования электронной микроскопии (SEM)

Overview

Сканирование электронной микроскопии (SEM) является мощным инструментом для изображения, в первую очередь- поверхностные особенности биологического образца. Правильная подготовка образца, однако, имеет решающее значение для получения качественных изображений. Это видео фокусируется на обезвоживание и сушки шаги подготовки нетронутыми взрослых Drosophila для SEM.

Protocol

Этот протокол является выдержкой из Koon et al.,Подготовка прокариотических и эукариотических организмов с использованием химической сушки для морфологического анализа в сканирующей электронной микроскопии (SEM), J. Vis. Exp. (2019).

1. Подготовка и фиксация

1. Приготовьте Drosophila меланогастер (фруктовая муха).
   1. Анестезия взрослых мух с использованием 100% углекислого газа. Поместите анестезировано взрослых (около 10 до 30 мух) в небольшой пластиковый флакон крышки винта или 1,5 мл центрифуги трубки.
   2. Погрузите анестезированую муху в 1 мл фиксатора (1,25% глутаралдегида, 0,1 М фосфатного буфера рН 7,2) на 2 ч (или на ночь) при 4 градусов по Цельсию. Если мухи плавают на поверхность фиксатора, добавьте несколько капель 2,5% полиэтиленгликоль терт-октилфенил эфира, чтобы ослабить поверхностное натяжение фиксатора, позволяющее полную погружение ткани. Удалите фиксатор с помощью стеклянной трубы.

2. Мытье и обезвоживание

1. Вымойте и обезвоживайте Drosophila melanogaster (фруктовая муха).
   1. Вымойте фиксированный образец три раза с 1 мл 0,1 м фосфатного буфера рН 7,2 при комнатной температуре в течение 10 мин в 1,5 мл микроцентрифуг трубки. Снимите каждую стирку стеклянной пипеткой, будьте осторожны, чтобы не удалить мух.
   2. Обезвоживать образец с помощью градуированных этанола серии, в течение 10 минут в объеме 1 мл в микрофуге трубки. Концентрации этанола: 25%, 50%, 75%, 80%, 95%, 100%. Удалите этанол со стеклянной пипеткой, будьте осторожны, чтобы не удалить мух.
   3. Сохранить образец в 1,5 мл микроцентрифуг трубки с достаточно 100% этанола, чтобы покрыть образец перед сушкой.

3. Сушка

1. Выполнить химической сушки с использованием hexamethyldisilazane (HMDS).
   1. Замените 100% раствор этанола раствором 1:2 HMDS и 100% этанолом в течение 20 мин. Замените раствор 1:2 раствором HMDS 2:1 и 100% этанолом в течение 20 мин. Замените решение 2:1 на 100% HMDS на 20 мин. Повторите один раз.
      Примечание: HMDS легковоспламеняющийся и острый токсин (дермальный маршрут). HMDS должны быть обработаны в химическом капоте дыма с использованием соответствующего личного защитного оборудования, включая перчатки, лабораторное пальто, и защита глаз.
   2. Перенесите образец в HMDS, если в трубке микроцентрифуга 1,5 мл, в одноразовое алюминиевое блюдо для взвешивания. Оказавшись в алюминиевом взвешивании блюдо, заменить 100% HMDS с достаточно свежих 100% HMDS для покрытия образца.
   3. Перенесите образец в пластиковый или стеклянный нео вакуумный десикатор со свежим desiccant (5-6 см глубиной) и поместите в химический дым капот. Кроме того, поместите образец непосредственно в химический капот дыма, чтобы высохнуть с рыхлой крышкой, например, коробку, чтобы предотвратить падение мусора на образец. Дайте образцу высохнуть в течение 12 до 24 ч.

4. Монтаж

1. Гора Дрозофила меланогастер (фруктовая муха).
   1. Этикетка нижней части алюминиевой крепления заглушки, чтобы указать, что находится на вершине.
      Поместите высушенных мух в нужное положение на клей или углеродный клей вкладку, закрепленную в верхней части заглушки под рассекающим микроскопом с точностью пинцета.
   2. Нанесите серебряный проводящий клей, т.е.серебряную краску, по внешним краям заглушек. Подключите серебряную краску к мухам с помощью зубочистки для обеспечения проводимости. Не позволяйте краске прикоснуться к нужной области изображения.
   3. Поместите заглушки в коробку держатель заглушки и поместите открытую коробку держатель заглушки в desiccator. Разрешить серебряную краску, чтобы высохнуть по крайней мере 3 ч или на ночь для наилучших результатов.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silver conductive adhesive 503	Electron Microscopy Sciences	12686-15
aluminum weighing dish	Fisher Scientific	08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm)	Electron Microscopy Sciences	75210
aluminum mounting stubs (25 mm)	Electron Microscopy Sciences	75186
Adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	76760
conductive carbon adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	77825
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)	VWR	97062-208
Hitachi 3400N-II SEM	Hitachi	https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/	The company doesn't appear to sell this model any longer