यह प्रोटोकॉल रेमेल्स और फलेगर से एक अंश है, ड्रोसोफिला लार्वा, जे विस एक्सपी (2016) में लिम्फ ग्रंथि और हीमोसाइट्स की जांच करने के तरीके।
1. लार्वा लिम्फ ग्रंथि इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री
नोट: लिम्फ ग्रंथि पृष्ठीय पक्ष पर मस्तिष्क के थोड़ा नीचे लार्वा के पूर्वकाल के अंत से लगभग एक तिहाई लंबाई स्थित है। (चित्रा 1बीमें तीर देखें.) लिम्फ ग्रंथि पृष्ठीय पोत को फ्लैंक करती है और मुंह के हुक या मस्तिष्क से जुड़ी सबसे आसानी से विच्छेदित होती है। जंगली प्रकार, तीसरा इंस्टार लिम्फ ग्रंथियां बहुत छोटी संरचनाएं हैं; प्राथमिक लोब्स लगभग 100 - 200 माइक्रोन लंबाई में हैं। (देखें चित्रा 2A.)
- इस परख के लिए लगभग एक ही विकासात्मक चरण के लार्वा प्राप्त करने के लिए, महिलाओं को 2 - 6 घंटे की एक निश्चित समय अवधि के लिए अंडे डालने की अनुमति देकर अंडे संग्रह को प्रतिबंधित करें।
- लिम्फ ग्रंथि विच्छेदन
- प्रत्येक प्रायोगिक स्थिति के लिए, 24-अच्छी प्लेट के एक कुएं में 1 मिलीलीटर 1x पीबीएस(टेबल 1)जोड़ें।
- डिस्पोजेबल ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से0.1%पीबी एसटी (टेबल 1) की 1 बूंद जोड़ें।
नोट: इस तरह के ट्वीन 20 के रूप में डिटर्जेंट, सतह तनाव को कम करने के लिए जोड़ा जाता है, ऊतक अच्छी तरह से नीचे करने के लिए सिंक करने के लिए अनुमति देता है ।
- प्लेट को बर्फ पर सपाट रखें।
- 1x पीबीएस से भरे डिश कुओं को विच्छेदन में लार्वा एकत्र करें।
- एक प्रबुद्ध स्टीरियोमाइक्रोस्कोप आधार पर एक साफ विच्छेदन पैड रखें। पैड पर 0.01% पीबीएएसटी(टेबल 1)की छोटी बूंदों को रखने के लिए डिस्पोजेबल ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करें। विच्छेदन के लिए एक लार्वा को पीबीस्ट ड्रॉप में स्थानांतरित करें।
- पीछे के अंत से लगभग एक चौथाई लंबाई, पृष्ठीय पक्ष ऊपर से संदंश की एक जोड़ी के साथ लार्वा पकड़ो।
- लार्वा पकड़े हुए संदंश के लिए तुरंत पूर्ववर्ती क्यूटिकल हड़पने के लिए संदंश की एक और जोड़ी का उपयोग करें। धीरे-धीरे पूर्वकाल के अंत की ओर कटिकल खींचें जब तक कि मुंह के हुक उजागर न हो जाएं।
नोट: इसका उद्देश्य किसी भी आंतरिक संरचनाओं को परेशान किए बिना छल्ली को छीलना है।
- क्यूटिकल को छोड़ें और लार्वा को दो में काटने के लिए दोनों संदंश का उपयोग करें। पीबीएएसटी ड्रॉप से पीछे के छोर को हटा दें।
नोट: यदि छल्ली मुंह के हुक के लिए सभी तरह से छील नहीं करता है, तो लार्वा को दो में काट लें और पीछे के छोर को हटा दें। क्यूटिकल के किनारे को पकड़ने के लिए एक जोड़ी संदंश का उपयोग करें, और उद्घाटन के माध्यम से मुंह के हुक को पुश करने के लिए संदंश की अन्य जोड़ी का उपयोग करें। इससे क्यूटिकल उलटा हो जाएगा और मुंह के हुक बेनकाब हो जाएंगे। इसका उपयोग वैकल्पिक विच्छेदन विधि के रूप में भी किया जा सकता है।
- स्थिरता के लिए क्यूटिकल (या तो वेंट्रल क्यूटिकल, पृष्ठीय क्यूटिकल फ्लैप, या दोनों) को पिन करने के लिए एक जोड़ी संदंश का उपयोग करें।
- उजागर मुंह हुक हड़पने के लिए संदंश की एक और जोड़ी का प्रयोग करें और धीरे से उन्हें बाहर खींच।
नोट: यह क्यूटिकल को आंतरिक संरचनाओं से अलग करेगा। आदर्श रूप में, आंख/एंटीनाल कल्पनाशील डिस्क, मस्तिष्क, अंगूठी ग्रंथि, और लस्सल पोत फ्लैंकिंग मुंह के हुक से जुड़ी रहेगी ।
- जबकि अभी भी मुंह हुक पकड़े हुए, ध्यान से इस तरह के लार ग्रंथियों, वसा शरीर, और आंत के रूप में अवांछित संरचनाओं को हटा दें ।
नोट: यदि मस्तिष्क मुंह के हुक से अलग होता है, तो लिम्फ ग्रंथि अभी भी मस्तिष्क से जुड़ी और एकत्र हो सकती है। इस मामले में मुंह के हुक की जगह वेंट्रल नर्व कॉर्ड पकड़ें।
- एक हैंडल के रूप में मुंह के हुक या वेंट्रल तंत्रिका कॉर्ड का उपयोग करके, बर्फ पर लिम्फ ग्रंथि युक्त विच्छेदित परिसर को अच्छी तरह से स्थानांतरित करें। निर्धारण से पहले 30 मिनट से अधिक न करें।
- फिक्सेशन और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री
- स्टीरियोमाइक्रोस्कोप बेस पर 24-वेल प्लेट रखें।
- पीबीएएसटी को कुएं से सावधानी से हटाने के लिए पी200 पिपेट का उपयोग करें।
नोट: खाली, पड़ोसी कुएं अस्थायी रूप से अपशिष्ट जमा करने के लिए उपयोगी होते हैं।
- धीरे-धीरे कुएं के किनारे 3.7% फॉर्मलडिहाइड(टेबल 1)जोड़ें और यह सुनिश्चित करने के लिए प्लेट को घूमता है कि विच्छेदित ऊतक पूरी तरह से जलमग्न हैं।
- 30 मिनट के लिए बर्फ के लिए थाली वापस । यदि लिम्फ ग्रंथियां फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एस) व्यक्त करती हैं, तो फोटोब्लेचिंग को रोकने के लिए प्लेट को कवर रखें।
- फिक्सेटिव को ध्यान से हटाने के लिए p200 पिपेट का उपयोग करें।
- अच्छी तरह से 200 μl 1x PBS जोड़कर धोएं और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए एक कक्षीय शेखर पर प्लेट रखकर। पीबीएस को ध्यान से हटाने के लिए पी200 पिपेट का उपयोग करें।
नोट: फिक्स्ड लिम्फ ग्रंथियों को पीबीएस में बर्फ पर तब तक छोड़ा जा सकता है जब तक कि सभी प्रायोगिक स्थितियों के लिए लिम्फ ग्रंथियों को विच्छेदित और तय नहीं किया जाता है।
- वॉश स्टेप्स को दो बार और दोहराएं।
- अच्छी तरह से 200 माइक्रोन पारमेबिलाइजेशन समाधान(टेबल 1)जोड़ें। आरटी में ४५ मिनट के लिए एक कक्षीय शेखर पर थाली सेट करें ।
नोट: ४५ मिनट लिम्फ ग्रंथि permeabilization के लिए "सोने के मानक" है, लेकिन लेखकों को केवल 20 मिनट के बाद सफलता है ।
- एक p200 पिपेट के साथ समाधान निकालें।
- प्रदाता के विनिर्देशों के अनुसार एंटीबॉडी समाधान(तालिका 1)के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें। कुएं में 300 माइक्रोन प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें और यह सुनिश्चित करें कि विच्छेदित ऊतक पूरी तरह से जलमग्न हैं। रात 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
- प्राथमिक एंटीबॉडी को हटाने के लिए एक p200 पिपेट का उपयोग करें।
- अच्छी तरह से 200 माइक्रोन 1x पीबीएस जोड़कर धोएं और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए एक कक्षीय शेखर पर प्लेट रखकर रखें। पीबीएस को ध्यान से हटाने के लिए पी200 पिपेट का उपयोग करें।
- वॉश स्टेप्स को दो बार और दोहराएं।
- प्रदाता के विनिर्देशों के अनुसार एंटीबॉडी समाधान के साथ माध्यमिक एंटीबॉडी को पतला करें। कुएं में 300 माइक्रोन सेकेंडरी एंटीबॉडी समाधान जोड़ें और यह सुनिश्चित करें कि विच्छेदित ऊतक पूरी तरह से जलमग्न हैं। आरटी में कम से 2 घंटे के लिए एक कक्षीय शेखर पर इनक्यूबेट ।
- माध्यमिक एंटीबॉडी को हटाने के लिए एक p200 पिपेट का उपयोग करें और चरण 1.3.12 और 1.3.13 में वर्णित के रूप में धो लें। अंतिम वॉश के बाद पीबीएस को न हटाएं।
- लिम्फ ग्रंथि बढ़ते
- साफ ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड 70% इथेनॉल(टेबल 1)और ऊतक पोंछे का उपयोग कर.
- प्रत्येक प्रायोगिक स्थिति के लिए, कांच की स्लाइड पर बढ़ते बफर(टेबल 1)की एक बूंद रखें।
नोट: एक स्लाइड पर दो स्थितियां फिट बैठती हैं । बढ़ते बफर मात्रा लिम्फ ग्रंथियों की संख्या पर निर्भर करता है घुड़सवार किया जाएगा । लगभग 18 - 20 लिम्फ ग्रंथियों के लिए 2 माइक्रोन का उपयोग करें, 10 - 12 के लिए 1 माइक्रोन, और 5 या उससे कम के लिए 0.5 माइक्रोन का उपयोग करें।
- माइक्रोस्कोप स्लाइड को एक प्रबुद्ध स्टीरियोमाइक्रोस्कोप बेस पर रखें।
- एक समय में दो शर्तों तक के लिए, एक हैंडल के रूप में मुंह के हुक या वेंट्रल तंत्रिका कॉर्ड का उपयोग करके, संदंश के साथ बढ़ते बफर में अच्छी तरह से लिम्फ ग्रंथियों के सभी हस्तांतरण करें।
- विच्छेदित ऊतकों को एक गोलाकार या आयताकार आकार में समान रूप से स्थान दें, इस प्रक्रिया में बढ़ते बफर को फैलाएं।
- प्रत्येक विच्छेदित ऊतकों के लिए, व्यक्तिगत रूप से, पृष्ठीय पोत के नीचे संदंश के एक टोंग स्लाइड करें और धीरे-धीरे बढ़ते बफर की परिधि की ओर खींचें।
नोट: यह लिम्फ ग्रंथि को विच्छेदित ऊतकों के बाकी हिस्सों से बाहर निकालेगा और कांच पर लिम्फ ग्रंथि को समतल करेगा।
- संदंश और एक काटने की गति के एक टोंग का उपयोग करके, लिम्फ ग्रंथि और मस्तिष्क के बीच पृष्ठीय पोत को काट दें।
- बफर के सबसे बाहरी किनारे पर, लिम्फ ग्रंथि के विपरीत दिशा में विच्छेदित ऊतकों के बाकी हिस्सों को ले जाएं।
नोट: अवांछित विच्छेदित ऊतक अंततः लिम्फ ग्रंथियों के चारों ओर एक परिधि बनाएंगे और एक समर्थन के रूप में काम करेंगे जिस पर कवरस्लिप आराम करेगा।
- जब तक लिम्फ ग्रंथियों के सभी विच्छेदित ऊतकों से अलग कर रहे हैं दोहराने, अवांछित विच्छेदित ऊतकों में से एक को केंद्र में जगह के लिए आरक्षित ।
- दो उंगलियों के बीच एक कवरलिप लें। चेक करें कि कवरलिप धूल और उंगलियों के निशान से मुक्त है। यदि आवश्यक हो, तो कवरस्लिप को साफ करने के लिए ऊतक पोंछ और 70% इथेनॉल का उपयोग करें।
- यह सुनिश्चित करना कि कवरस्लिप का किनारा ग्लास स्लाइड के किनारे के समानांतर है, बढ़ते बफर पर कवरस्लिप को ध्यान से कम करें।
नोट: माइक्रोस्कोप स्लाइड इमेजिंग से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। अधिकतम भंडारण समय इस्तेमाल किए गए एंटीबॉडी की स्थिरता पर निर्भर करता है। 24- अच्छी तरह से प्लेटों को धोया और पुन: इसित किया जा सकता है।
2. इमेजिंग
- छवि तय hemocytes और एक उपयुक्त मानक फ्लोरेसेंस या निर्माता के ऑपरेटिंग मैनुअल के अनुसार उच्च आवर्धन पर 20X या उच्च आवर्धन पर कंफोकल माइक्रोस्कोप पर लिम्फ ग्रंथियों घुड़सवार । निर्माता के ऑपरेटिंग मैनुअल के अनुसार 2X आवर्धन पर एक मानक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप पर छवि पूरे लार्वा।
- यदि वांछित हो तो, विहित करने के लिए सॉफ्टवेयर प्रदाता के निर्देशों का पालन करें।
