Larval лимфы Гланд вскрытие: Изоляция Drosophila гемоцитов производства органа

Overview

Это видео описывает Дрозофила лимфатической железы-основной сайт гематопоизиса в личинке мухи-и показывает пример протокола для вскрытия и установки органа для иммуногистохимии и флуоресцентной визуализации.

Protocol

Этот протокол является выдержкой из Реймельса и Пфлегер, Методы изучения лимфатических желез и гемоцитов в Drosophila Larvae, J. Vis. Exp. (2016).

1. Ларвал лимфланд иммуногистохимия

ПРИМЕЧАНИЕ: Лимфатическая железа расположена примерно на треть длины от переднего конца личинки чуть ниже мозга на спинной стороне. (См. стрелку на рисунке 1B.) Лимфатическая железа фланги спинного сосуда и легче всего вскрыть прилагается к рот крючки или к мозгу. Дикий тип, третий instar лимфатических желез очень маленькие структуры; первичные доли имеют длину от 100 до 200 мкм. (См. рисунок 2A.)

1. Чтобы получить личинки примерно такой же стадии развития для этого анализа, ограничить сбор яйцеклеток, позволяя женщинам откладывать яйца в течение фиксированного периода времени 2 - 6 часов.
2. Вскрытие лимфатических желез
   1. Для каждого экспериментального состояния добавьте 1 мл 1x PBS(таблица 1) к одному колодец 24-хорошо пластины.
   2. Добавьте 1 каплю 0,1% PBST (таблица1) к каждойхорошо с помощью одноразового перетока передачи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Моющее средство, такое как Tween 20, добавляется для снижения поверхностного натяжения, позволяя ткани опускаться на дно колодец.
   3. Поместите тарелку плашмя на лед.
   4. Собирайте личинки в колодцах для вскрытия посуды, наполненных 1x PBS.
   5. Поместите чистую вскрытую площадку на подсвеченную стереомикроскопную основу. Используйте одноразовый трубоуго перехода для того чтобы поместить малые падения 0.01% PBST(таблица 1) на площадке. Перенесите одну личинку в каплю PBST для вскрытия.
   6. Держите личинку с одной парой типсов примерно на четверть длины от заднего конца, спинной стороной вверх.
   7. Используйте другую пару типсов, чтобы захватить кутикулу непосредственно перед типсами, которые держат личинку. Аккуратно потяните кутикулу к передней части, пока рот крючки подвергаются.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы очистить кутикулу, не нарушая каких-либо внутренних структур.
   8. Отпустите кутикулу и используйте оба типса, чтобы разрезать личинку на две части. Удалите задний конец с капли PBST.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если кутикула не очищается в рот крючки, разрезать личинку на две части и удалить задний конец. Используйте одну пару типсов, чтобы удерживать край кутикулы, и использовать другую пару типсов, чтобы нажать на крючки рта через отверстие. Это инвертировать кутикулу и подвергать рот крючки. Это может быть использовано в качестве альтернативного метода вскрытия, а также.
   9. Используйте одну пару типсов, чтобы приколоть кутикулу (или вентраль кутикулы, спинной кутикулы лоскут, или оба) для стабильности.
   10. Используйте другую пару типсов, чтобы захватить открытые крючки рот и осторожно вытащить их.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Это отделит кутикулу от внутренних структур. В идеале, глаз / антенны мыслимые диски, мозг, кольцо железы, и лимфатических желез фланговых спинного сосуда будет оставаться прилагается к рот крючки.
   11. Хотя по-прежнему проведение рот крючки, тщательно удалить нежелательные структуры, такие как слюнные железы, жировое тело, и кишечника.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Если мозг отделяется от крючков рта, лимфатическая железа все еще может быть прикреплена и собрана с мозгом. В этом случае держите брюшной нервный шнур вместо крючков для рта.
   12. Используя крючки для рта или желудочковый нервный шнур в качестве ручки, перенесите расчлененный комплекс, содержащий лимфатическую железу, в колодец на льду. Не превышать 30 минут до фиксации.
3. Фиксация и иммуногистохимия
   1. Поместите 24-хорошо пластины на стереомикроскоп базы.
   2. Используйте р200 пипетки, чтобы тщательно удалить PBST из хорошо.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пустые, соседние скважины полезны для временного депонирования отходов.
   3. Аккуратно добавьте 200 мкл 3,7% формальдегида(таблица 1)вниз по стороне колодец и закружить пластину, чтобы убедиться, что расчлененные ткани полностью погружены.
   4. Вернуть тарелку на лед на 30 мин. Если лимфатические железы выражают флуоресцентный белок (ы), держите пластину покрытой, чтобы предотвратить фотоотбел.
   5. Используйте р200 пипетки, чтобы тщательно удалить фиксатор.
   6. Вымойте, добавив 200 мкл 1x PBS к колодец и поместив пластину на орбитальный шейкер в течение 5 мин при комнатной температуре. Используйте р200 пипетки, чтобы тщательно удалить PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксированные лимфатические железы могут быть оставлены на льду в PBS до тех пор, пока лимфатические железы для всех экспериментальных условий вскрываться и фиксированной.
   7. Повторите шаги мытья еще два раза.
   8. Добавьте в колодец раствор пермеабилизации 200 мкл (таблица1). Установите пластину на орбитальный шейкер в течение 45 минут на RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 45 мин является "золотым стандартом" для промибилизации лимфатических желез, но авторы имеют успех только после 20 мин.
   9. Удалите раствор с помощью р200 пипетки.
   10. Разбавить первичное антитело раствором антитела(таблица 1)в соответствии со спецификациями поставщика. Добавьте в колодец 300 мкл первичного антитела и убедитесь, что вскрытые ткани полностью погружены в воду. Инкубировать при 4 градусов по Цельсию на ночь.
   11. Используйте р200 пипетки для удаления первичного антитела.
   12. Вымойте, добавив 200 мкл 1x PBS к колодец и поместив пластину на орбитальный шейкер в течение 10 минут при комнатной температуре. Используйте р200 пипетки, чтобы тщательно удалить PBS.
   13. Повторите шаги мытья еще два раза.
   14. Разбавить вторичное антитело раствором антител в соответствии со спецификациями поставщика. Добавьте в колодец вторичное антитело на 300 мкл и убедитесь, что расчлененные ткани полностью погружены в воду. Инкубировать на орбитальном шейкере, по крайней мере 2 часа на RT.
   15. Используйте р200 пипетку для удаления вторичных антител и мытья, как описано в шагах 1.3.12 и 1.3.13. Не снимите PBS после окончательной стирки.
4. Лимфланд монтажа
   1. Чистый стеклянный микроскоп скользит с использованием 70%этанола (таблица 1)и тканевых салфеток.
   2. Для каждого экспериментального состояния поместите одну каплю крепления буфера(таблица 1)на стеклянную горку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Два условия подходят на одном слайде. Объем буфера зависит от количества лимфатических желез, которые будут установлены. Используйте 2 мкл примерно для 18 - 20 лимфатических желез, 1 мкл для 10 - 12, и 0,5 мкл для 5 или меньше.
   3. Поместите слайд микроскопа на освещенную базу стереомикроскопа.
   4. Для до двух условий в то время, передача всех лимфатических желез из хорошо монтаж буфера с типсами, используя рот крючки или брюшной нервный шнур в качестве ручки.
   5. Пространство расчлененных тканей равномерно в круглой или прямоугольной форме, распространяя монтаж буфера в этом процессе.
   6. Для каждой из расчлененных тканей, индивидуально, сдвиньте один щипец щипцов под спинной сосуд и аккуратно потяните к периферии монтажного буфера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это привлечет лимфатическую железу из остальных вскрытых тканей и сгладить лимфатическую железу на стекле.
   7. Используя один щипец щипцов и распиловка движения, сократить спинной сосуд между лимфатической железы и мозга.
   8. Переместите остальные вскрытые ткани на противоположную сторону лимфатической железы, на внешний край буфера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нежелательные расчлененные ткани в конечном итоге образуют периметр вокруг лимфатических желез и служат в качестве поддержки, на которой обложка будет отдыхать.
   9. Повторяйте до тех пор, пока все лимфатические железы не будут отделены от расчлененных тканей, зарезервировав одну из нежелательных вскрытых тканей для места в центре.
   10. Возьмите крышку между двумя пальцами. Убедитесь, что обложка свободна от пыли и отпечатков пальцев. При необходимости используйте салфетку и 70% этанола для очистки крышки.
   11. Обеспечение того, чтобы край крышки был параллельны краю стеклянной горки, тщательно опустите крышку над монтажным буфером.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Микроскоп слайды могут храниться при 4 градусов по Цельсию до изображения. Максимальное время хранения зависит от стабильности используемых антител. 24-хорошо пластины могут быть промыты и повторно использованы.

2. Изображение

1. Изображение фиксированных гемоцитов и установленных лимфатических желез на соответствующей стандартной флуоресценции или конфокального микроскопа на 20X или выше увеличение в соответствии с руководством производителя по эксплуатации. Изображение целых личинок на стандартном стереомикроскопе при увеличении 2X в соответствии с руководством производителя по эксплуатации.
2. Следуйте инструкциям поставщика программного обеспечения для деконволюции, при желании.

Representative Results

Рисунок 1: В Виво Кристаллическая меланизация клеток. A) Личинки были помещены индивидуально в трубы ПЦР до нагрева. Красные стрелки указывают на личинки, которые не находятся в нижней части труб. B) Типичный кристаллический образец меланизации клеток после нагрева, который иногда показывает лимфатическую железу (стрелка; спинная сторона показана, передняя остается). Шкала бар представляет 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Ларвал лимфатической гланд иммуногистохимии. A) DIC изображение третьей instar личиночной лимфатической железы, показывающей спинной сосуд (dv), первичные доли (1 ") и вторичные доли (2 "). Шкала бар представляет 100 мкм. B) представитель третьей instar личинок лимфатической железы из личинки генетически выражая EBFP2 в медуллярной зоне и GFP в задней сигнального центра. Лимфатическая железа была окрашена антителом против внутриклеточного домена Notch (красный). Безальтерное изображение, взятое с помощью флуоресцентного микроскопа (вверху). То же изображение после деконволюции (внизу). Шкала баров составляет 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS tablets	MP Biomedicals	2810305
dissecting dish	Corning	7220-85
microcentrifuge tube	Denville	C2170
silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit	Krayden (distributed through Fisher)	NC9644388 (Fisher catalog number)	Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions.
stereomicroscope	Morrell Instruments (Nikon distributor)	mna42000, mma36300	Nikon models SMZ1000 and SMZ645
tissue wipe	VWR	82003-820
forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-DZ
p200 pipette	Eppendorf	3120000054
formaldehyde	Fisher	BP531-500
Triton	Fisher	BP151-500
Tween 20	Fisher	BP337-500
bovine serum albumin	Rocky Mountain Biologicals	BSA-BSH-01K
normal goat serum	Sigma	G9023-10ML
normal donkey serum	Sigma	D9663-10ML
200 proof ethanol	VWR	V1001
N-propyl gallate	MP Biomedicals	102747
glycerol	VWR	EM-4750
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	Fisher	62248
microscope cover glass, 18 mm circular	Fisher	12-545-100
glass microscope slides	Fisher	22-034-980
24-well plate	Corning	351147
disposable transfer pipet	Fisher	13-711-9AM
fluorescence microscope	Zeiss		Axio Imager.Z1