Procesamiento de patas de insectos para microscopía de fluorescencia: un método para preservar estructuras neuromusculares para imágenes

Overview

Este video describe un método para diseccionar, arreglar y montar la pierna adulta De Drosophila mientras preserva su neuromusculatura intacta para el análisis de imágenes.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Guan et al., Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle, J. Vis. Exp. (2018).

1. Disección y fijación de las piernas

1. Tome una placa de vidrio multi-pozo y llene el número apropiado de pozos con 70% de etanol. Añadir 15-20 CO₂moscas anestesiadas (de cualquier sexo y cualquier edad) a cada pozo y mediante el uso de un cepillo, suavemente dab las moscas en la solución de etanol hasta que las moscas están completamente sumergidas.
   NOTA: Este paso es eliminar la hidrofobicidad de la cutícula. No lave durante más de 1 min, ya que esto aumenta la fluorescencia automática de la cutícula.
2. Enjuague las moscas 3 veces con la solución de detergente tensioactivo no iónico al 0,3% en solución de detergente con fosfato 1x (PBS). Mantenga las moscas en esta solución durante al menos 10 minutos.
   NOTA: Las piernas se fijan mejor cuando se incluye detergente, lo que es probable que aumente la penetración del fijador dentro de la pierna.
3. Coloque una placa multi-pozo sobre el hielo junto con un tubo de 4% paraformaldehído (PFA).
   NOTA: La preparación de PFA fresca del 4% a partir de una solución de stock libre de etanol PFA del 16% es fundamental.
4. Utilice fórceps para extirpar la cabeza y el abdomen de las moscas sin dañar el segmento torácico o las piernas.
   NOTA: Extirpar el abdomen hace que sea más fácil sostener la mosca y diseccionar las piernas.
5. Disecciona las piernas del segmento torácico con fórceps y coloca las piernas en los pozos que contienen un 4% de PFA. Para ello, empuje suavemente pero firmemente en la unión coxa-tórax usando la punta de los fórceps finos hasta que la pierna se desapego.
6. Fijar las piernas en 4% PFA durante la noche a 4 °C (aproximadamente 20 h en total).
7. Lave las piernas con una solución de detergente tensioactivo no iónico al 0,3% en 1x PBS, 5x durante 20 min cada una.
8. Reemplace el búfer de lavado por el medio de montaje. Mantenga la pierna en medio de montaje durante al menos un día antes del montaje para permitir su penetración completa en la pierna.
   NOTA: Si el medio de montaje es altamente viscoso, diluya el medio de montaje al 80% con 1x PBS porque el cambio repentino en la viscosidad puede hacer que la cutícula colapse y dañe la estructura general de la pierna. Dependiendo del conductor Gal4, las moscas se pueden conservar durante 1 a 3 semanas a 4 °C en medios de montaje hasta el montaje.

2. Montaje de las piernas

1. Coloque aproximadamente 20 μL de 70% de glicerol en el lado izquierdo de un portaobjetos del microscopio y cubra con un punto cuadrado de 22 x 22 mm² (Figura 1A,B). Pipeta de aproximadamente 10 μL de medio de montaje a lo largo de una línea paralela y a una pequeña distancia del borde derecho de este tubo. Añadir otros 30 μL de medio de montaje más adelante en el lado derecho de la diapositiva (Figura 1C).
   NOTA: Al aplicar un control de cubierta sobre las piernas (ver más abajo) el medio de montaje se extenderá suavemente debajo de la cubierta y alrededor de las piernas sin desplazarlas.
2. El uso de fórceps finos levanta la pierna de la solución y la coloca suavemente en el medio de montaje cerca de la cubierta izquierda. Haga lo mismo por cada pierna y alinee de arriba a abajo (Figura 1D).
   1. Levante y transfiera las piernas en una gota de medio sostenido entre ambas puntas de los fórceps. Oriente las piernas de dos maneras: lado externo hacia arriba o hacia abajo.
3. Una vez que todas las patas (hasta 6-8 patas se pueden montar) están correctamente alineadas, coloque una segunda mancha de cubierta sobre las piernas de tal manera que este cubrecabes se apoye ligeramente en el punto de cubierta previamente colocado Figura 1E para permitir espacio entre el deslizamiento de cubierta y el tejido y evitar que las piernas se dañen(Figura 1G).
   NOTA: Alternativamente, utilice pozos de pegatinas o cera de ortodoncia para crear espacio entre el deslizamiento de cubierta y la diapositiva.
4. Utilice un esmalte de uñas para fijar la posición de las cubiertas en cada esquina (Figura 1F).
   NOTA: El tejido ya está listo para ser imagen.

Representative Results

Figura 1: Procedimiento para montar las piernas en diapositivas del microscopio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol absolute	Fisher	E/6550DF/17	Absolute analytical reagent grade
nonionic surfactant detergent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100, for molecular biology
Fine forceps	Sigma-Aldrich	F6521	Jewelers forceps, Dumont No. 5
Glass multi-well plate	Electron Microscopy Sciences	71563-01	9 cavity Pyrex, 100 mm x 85 mm
PFA	Thermofisher	28908	Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free
Glycerol	Fisher BioReagents	BP 229-1	Glycerol (Molecular Biology)
Spacers	Sun Jin Lab Co	IS006	iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep
Square 22 mm x 22 mm coverslips	Fisher Scientific	FIS#12-541-B	No. 1.5-0.16 to 0.19 mm thick
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Vectashield Antifade Mounting Medium