Overview
Dieses Video beschreibt eine Methode, um die Chorion- und Vitelline-Membranen von zuvor fixierten reifen Drosophila-Oozyten mechanisch zu entfernen. Das vorgestellte Protokoll zeigt eine detaillierte Demonstration des Verfahrens, das Eizellen ergibt, die mit fluoreszierenden In-situ-Hybridisierungstests kompatibel sind.
Protocol
Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Perkins und Bickel, Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2017).
1. Entfernung von Chorionen und Vitelline Membranen
HINWEIS: Siehe Abbildung 1 für benötigte Werkzeuge.
- Separate Spätstadium Oozyten
- 1 ml PBSBTx zu einer flachen Sezierenderschale hinzufügen. Verwenden Sie eine P200 mit einer BSA-beschichteten Spitze, um feste Eierstöcke (in 150 l) in die flache Schale zu übertragen. Pipette Ovarien auf und ab mit der BSA beschichteten Pipettenspitze, um die reifen Eizellen von den weniger reifen Eizellen zu lösen.
- Wenn die Oozyten im späten Stadium ausreichend getrennt sind, übertragen Sie das gesamte Gewebe in ein 500-L-Mikrofuge-Rohr. Überschüssige Flüssigkeit mit einer gezogenen Pasteur-Pipette entfernen und ca. 150 - 200 l im Rohr lassen. Wiederholen Sie Abschnitt 1.1 für die verbleibenden Genotypen.
- Vorbereiten für das Rollen
- Vorbefeuchten sie eine tiefe Brunnenschale mit 200 l PBSBTx. Bedecken und beiseite stellen. Erhalten Sie 3 Milchglasrutschen und stellen Sie die #3 beiseite. Reiben Sie die milchigen Glasbereiche von Dias #1 und #2 vorsichtig zusammen. Spülen Sie sie in entionisiertem Wasser, um alle Glasscherben zu entfernen und trocknen Sie mit einem Einwegtuch.
- Beschichten Sie die frostigen Bereiche von Dias #1 und #2 mit PBSBTx, indem Sie einem Dia 50 L PBSBTx hinzufügen und diesen Bereich mit dem anderen Schieberegler reiben. Entfernen Sie die Flüssigkeit mit einem Einwegtücher.
- Platzieren Sie die Dias unter einem Sezierendes Mikroskop in der in Abbildung 2Adargestellten Konfiguration. Halten Sie die frostigen Bereiche von Dias #1 und #2 in Kontakt, mit #3, die #2.
- Roll Oozyten; sicherstellen, dass die Richtung des Walzens immer in einer geraden Linie und nie in einer kreisförmigen Bewegung ist.
- Eine P200-Pipettespitze in PBSBTx vorbefeuchten und die Eizellen im Mikrofugerohr dispergieren, indem Sie nach oben und unten pfeifen. Übertragen Sie 50 l Flüssigkeit, die Eizellen enthält, in die Mitte des Milchglasteils des #1. Heben Sie die Rutsche #2, um dies zu tun.
- Langsam tiefer gleiten #2, bis die Oberflächenspannung der Flüssigkeit eine Abdichtung zwischen den beiden Milchglasbereichen erzeugt. Es sollte genügend Flüssigkeit vorhanden sein, um den frostigen Bereich abzudecken, aber keine sollte ausgesickern. Wenn Flüssigkeit überfließt, verwenden Sie eine gezogene Pasteur Pipette, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
- Halten Sie die untere Folie (#1) mit einer Hand an Ort und Stelle und bewegen Sie die obere Folie (#2) in horizontaler Richtung hin und her, wobei slide #2 Ebene gehalten und auf #3 unterstützt werden. Führen Sie unter dem Mikroskop für eine einfache Visualisierung von Eizellenbewegungen und Fortschritt.
HINWEIS: Diese Bewegung erzeugt Reibung und bewirkt, dass die Eizellen "rollen" und ihre Kränzen verlieren. Minimaler Druck sollte verwendet werden und Bewegungen sollten kurz und schnell sein. - Nach einigen Bewegungen in horizontaler Richtung den Bewegungswinkel leicht ändern (Abbildung 2B). In mehreren Schritten diesen Winkel schrittweise auf 90° erhöhen, bis die Bewegung des oberen Schlittens (#2) senkrecht zur Startrichtung ist (Abbildung 2B). Beachten Sie, dass leere Krähen in der Flüssigkeit sichtbar sind und Eizellen ohne Kränewiederkeit länger und dünner erscheinen.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.3.3 - 1.3.4 etwa 7 - 10 Mal, bis die Lösung leicht bewölkt wird. Hören Sie auf zu rollen, wenn die Mehrheit der Eizellen (75 - 85%) ihre Vitelline-Membranen verloren zu haben.
HINWEIS: Ein markantes spitzes Ende ist oft auf Eizellen ohne Vitelline-Membranen sichtbar. Vitelline-Membranen sind schwieriger zu entfernen als Sehnen. Während des Walzens kann ein leichter Druck auf den oberen Schlitten (Schiebe#2) ausgeübt werden, um die Entfernung von Vitelline-Membranen zu erreichen. Der Versuch, Vitelline-Membranen von allen Eizellen zu entfernen, führt oft zur Zerstörung anderer Eizellen. - Heben Sie die obere Rutsche (#2 sanft an und ziehen Sie eine ihrer Ecken in die Mitte des frostigen Bereichs des unteren Schlittens (#1), so dass sich gerollte Eizellen in der Mitte des frostigen Bereichs ansammeln. Spülen Sie Eizellen von beiden Dias mit PBSBTx in die tiefe Brunnenschale, die PBSBTx enthält.
- Reinigen Sie Rutschen #1 und #2 mit Reinstwasser, trocknen Sie mit einem Einwegtuch und setzen Sie ihn zurück. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.1 - 1.3.6, bis alle Eizellen desselben Genotyps gerollt sind. Dies erfordert in der Regel 3 - 4 Runden Rollen pro Genotyp.
- Entfernen Sie Diebe nach dem Walzen
- 1 ml PBSBTx zu einem 15 ml konischen Rohr hinzufügen. Wirbeln Sie die Flüssigkeit, um die Seiten des Rohres zu beschichten.
- Mit einer PBSBTx-beschichteten P1000-Pipettespitze die gerollten Eizellen von der Tiefenbrunnenschale in das konische Rohr mit 1 ml PBSBTx übertragen. Fügen Sie dem konischen Rohr, das die Oozyten enthält, weitere 2 ml PBSBTx hinzu.
- Lassen Sie die Eizellen beginnen, sich nach unten zu setzen, dann entfernen Sie die oberen 2 ml Lösung mit Schmutz (Chorionen, Vitelline, etc.)mit einem P1000 und entsorgen. Halten Sie bei Bedarf die konische Röhre vor einem dunklen Hintergrund, um die undurchsichtigen Eizellen beim Sinken zu sehen.
- Fügen Sie den Oozyten weitere 2 ml PBSBTx hinzu, und wiederholen Sie Schritt 1.4.3. Wiederholen Sie 1.4.3. für insgesamt 3 Runden Schuttentfernung.
- Übertragen Sie Dieoozyten mit einer PBSBTx-beschichteten P1000-Pipettespitze zurück in das originale 500-L-Mikrofugerohr. 20 - 25 Weibchen sollten etwa 50 l gewalzte reife Eizellen ergeben.
- Wiederholen Sie Abschnitt 4 für die übrigen Genotypen mit frischen matten Dias, einer sauberen Tiefenbohrung und einem neuen konischen Rohr für jeden Genotyp.
- Wenn eine Lagerung erforderlich ist, die Eizellen auf 1x PBS mit 0,1% TritionX-100 übertragen und über Nacht bei 4 °C lagern. Eine langfristige Lagerung wird nicht empfohlen, da die Formaldehydvernetzung durch nichtionische Reinigungsmittel umgekehrt werden kann.
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Representative Results
Abbildung 1: Zytologie-Tools. Im Protokoll verwendete Werkzeuge: (1) Zangenpaar (#5 Dumont); (2) Wolframnadel; (3) tiefe Brunnenschale mit Deckel; (4) flache Glassezieren; (5) gezogenpasteur Pipette. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Anordnung und Bewegung von Dias für rollende Eizellen. (A) Diagramm der Folie, die für das Rollen von Eizellen eingerichtet ist, wie im Protokoll beschrieben. Der dunklere Bereich bezeichnet den Milchglasteil der Rutsche. (B) Richtung der Bewegungsvektoren für #2 während des Eizellenwalzens. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | Prepare 10% stock Freeze aliquots |
| 10% Triton X-100 | Thermo Scientific | 28314 | Surfact-Amps |
| PBSBTx | 1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100 | ||
| Forceps | Dumont | #5 INOX, Biologie | |
| 9" Disposable glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | Autoclave to sterilize |
| Shallow glass dissecting dish | Custom made | ||
| Deep well dish (3 wells) | Pyrex | 7223-34 | |
| Tungsten needle | homemade | ||
| Frosted glass slides, 25 x 75 mm | VWR Scientific | 48312-002 | |
| 15 mL conical tubes | Various | ||
| 500 µl microfuge tubes | Various | ||
| Kimwipes | Various | disposable wipes |
