Remoção mecânica da membrana de chorão e vitelline: um método para preparar oócitos de Drosophila para observação direta

Overview

Este vídeo descreve um método para remover mecanicamente as membranas de corão e vitelline de oócitos Drosophila maduros previamente fixos. O protocolo em destaque mostra uma demonstração detalhada do procedimento que produz oócitos compatíveis com ensaios fluorescentes de hibridização in situ.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Perkins e Bickel, usando fluorescência na Hibridização Situ (FISH) para monitorar o Estado de Coesão de Braço em Prometaphase e Metaphase I Drosophila Oócitos, J. Vis. Exp. (2017).

1. Remoção de acordes e membranas vitelinas

NOTA: Consulte a Figura 1 para obter as ferramentas necessárias.

1. Oócitos separados em estágio final
   1. Adicione 1 mL PBSBTx a um prato de dissecação rasa. Use um P200 com uma ponta revestida BSA para transferir ovários fixos (em ~150 μL) para o prato raso. A pipeta os ovários para cima e para baixo com a ponta de pipeta revestida BSA para desalojar os oócitos maduros dos oócitos menos maduros.
   2. Quando os oócitos em estágio tardio estiverem suficientemente separados, transfira todo o tecido para um tubo de microfuça de 500 μL. Remova o excesso de líquido com uma pipeta Pasteur puxada, deixando cerca de 150 - 200 μL no tubo. Repita a seção 1.1 para os genótipos restantes.
2. Prepare-se para rodar
   1. Pré-molhado um prato bem profundo com 200 μL de PBSBTx. Cubra e reserve. Obtenha 3 lâminas de vidro foscos e reserve o slide #3. Esfregue suavemente as regiões de vidro fosco de lâminas #1 e #2 juntos. Enxágüe-os em água deionizada para remover quaisquer cacos de vidro e seque com um lenço descartável.
   2. Cubra as regiões foscas de slides #1 e #2 com PBSBTx adicionando 50 μL de PBSBTx a um slide e esfregando esta região com o outro slide. Remova o líquido com um lenço descartável.
   3. Coloque os slides sob um microscópio dissecando na configuração mostrada na Figura 2A. Mantenha as regiões foscas de slides #1 e #2 em contato, com slides #3 suporte #2.
3. Roll oócitos; garantir que a direção de rolar está sempre em linha reta e nunca em um movimento circular.
   1. Prewet uma ponta de pipeta P200 em PBSBTx e disperse os oócitos no tubo de microfuge por tubulação para cima e para baixo. Transfira 50 μL de líquido contendo oócitos para o centro da parte de vidro fosco da #1 de slides. Levante #2 para fazer isso.
   2. Lentamente abaixe o #2 até que a tensão superficial do líquido crie uma vedação entre as duas regiões de vidro fosco. Deve haver líquido suficiente para cobrir a área gelada, mas nenhum deve sair. Se o líquido estiver transbordando, use uma pipeta Pasteur puxada para remover o excesso de líquido.
   3. Segure o slide inferior (#1) no lugar com uma mão e use a outra mão para mover o slide superior (#2) para frente e para trás em uma direção horizontal, mantendo o #2 nível de deslizamento e suportado no slide #3. Executar sob um microscópio para fácil visualização de movimentos oócitos e progresso.
      NOTA: Esse movimento vai gerar atrito e fazer com que os oócitos "rolem" e percam seus acordes. A pressão mínima deve ser usada e os movimentos devem ser curtos e rápidos.
   4. Após alguns movimentos na direção horizontal, altere ligeiramente o ângulo de movimento(Figura 2B). Em múltiplos incrementos, aumente gradualmente esse ângulo para 90° até que o movimento do slide superior (#2) seja perpendicular à direção inicial(Figura 2B). Note que acordes vazios serão visíveis no líquido e os oócitos sem acordes aparecerão mais longos e mais finos.
   5. Repetimos as etapas 1.3.3 - 1.3.4 cerca de 7 - 10 vezes até que a solução fique ligeiramente nublada. Pare de rolar quando a maioria dos oócitos (75 - 85%) parecem ter perdido suas membranas vitelinas.
      NOTA: Uma extremidade pontiaguda distinta é frequentemente visível em oócitos sem membranas vitelinas. As membranas vitelinas são mais difíceis de remover do que os acordes. A pressão leve pode ser aplicada ao slide superior (slide #2) enquanto rola para obter a remoção das membranas vitelline. Tentar remover membranas vitelinas de todos os oócitos muitas vezes resulta em destruição de outros oócitos.
   6. Levante suavemente o escorregador superior (#2), arrastando um de seus cantos para o centro da região fosca do escorregador inferior (#1) para que os oócitos laminados se acumulem no centro da região gelada. Enxágüe oócitos de ambos os slides com PBSBTx no prato de poço profundo contendo PBSBTx.
   7. Limpe as lâminas #1 e #2 com água ultrauso, seque com um lenço descartável e reinicie. Repetimos as etapas 1.3.1 - 1.3.6 até que todos os oócitos do mesmo genótipo tenham sido enrolados. Isso geralmente requer 3 - 4 rodadas de rolagem por genótipo.
4. Remova os detritos após o rolamento
   1. Adicione 1 mL PBSBTx a um tubo cônico de 15 mL. Gire o líquido para revestir as laterais do tubo.
   2. Usando uma ponta de pipeta P1000 revestida de PBSBTx, transfira os oócitos laminados do prato do poço profundo para o tubo cônico contendo 1 mL de PBSBTx. Adicione mais 2 mL de PBSBTx ao tubo cônico contendo os oócitos.
   3. Que os oócitos comecem a se acomodar até a parte inferior, depois remova os 2 mL superiores da solução contendo detritos (acordes, vitellines, etc.) com um P1000 e descarte. Se necessário, segure o tubo cônico contra um fundo escuro para ver os oócitos opacos enquanto afundam.
   4. Adicione mais 2 mL de PBSBTx aos oócitos e repita o passo 1.4.3. Repita 1.4.3. para um total de 3 rodadas de remoção de detritos.
   5. Usando uma ponta de pipeta P1000 revestida de PBSBTx, transfira oócitos de volta para o tubo de microfuça original de 500 μL. 20 - 25 fêmeas devem produzir aproximadamente 50 μL de oócitos maduros enrolados.
5. Repita a seção 4 para os genótipos restantes usando lâminas foscas frescas, um prato de poço profundo limpo e um novo tubo cônico para cada genótipo.
6. Se for necessário armazenamento, transfira oócitos para 1x PBS com TritionX-100 de 0,1% e armazene durante a noite a 4 °C. O armazenamento a longo prazo não é recomendado porque o crosslinking de formaldeído pode ser revertido por detergentes não iônicos.

Representative Results

Figura 1: Ferramentas de citologia. Ferramentas utilizadas no protocolo: (1) par de fórceps (#5 Dumont); (2) agulha de tungstênio; (3) prato bem profundo com cobertura; (4) prato de dissecação de vidro raso; (5) puxou a pipeta Pasteur. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Arranjo e movimento de slides para oócitos de rolamento. (A) Diagrama do slide configurado para rolagem de oócitos conforme descrito no protocolo. A área mais escura denota a parte de vidro fosco do escorregador. (B) Direção dos vetores de movimento para #2 de slides durante a rolagem de oócito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP1600-100	Prepare 10% stock Freeze aliquots
10% Triton X-100	Thermo Scientific	28314	Surfact-Amps
PBSBTx			1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100
Forceps	Dumont		#5 INOX, Biologie
9" Disposable glass Pasteur pipettes	Fisher	13-678-20C	Autoclave to sterilize
Shallow glass dissecting dish			Custom made
Deep well dish (3 wells)	Pyrex	7223-34
Tungsten needle			homemade
Frosted glass slides, 25 x 75 mm	VWR Scientific	48312-002
15 mL conical tubes	Various
500 µl microfuge tubes	Various
Kimwipes	Various		disposable wipes