Neglebånd Disruption: En metode til at indsamle Hæmolymph fra Drosophila Larver

Abstract

Kilde: Reimels, T. A. og Pfleger, C.M. Metoder til at undersøge lymfekirtlen og hæmocytter i Drosophila Larver. J. Vis. Exp. (2016).

Den Drosophila hemolymph tjener som både blod og interstitiel væske, cirkulerer i hele kroppen i larven og voksne stadier. Denne video beskriver en protokol til at indsamle larve hæmolymph for at kvantificere de cirkulerende celler.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Reimels og Pfleger, Metoder til at undersøge lymfekirtlen og hæmocytterne i Drosophila Larver, J. Vis. Exp. (2016).

1. Cirkulerende Hemocyte Koncentration

1. For at opnå larver af omtrent samme udviklingsstadium til denne analyse, begrænse ægopsamlingen ved at tillade kvinder at lægge æg i en fast periode på 2 - 6 timer.
2. Saml larver i dissekere parabol brønde fyldt med 1x fosfat buffered saltvand (PBS).
3. For hver larve anbringes 10 μl 1x PBS i et mikrocentrifugerør på is og 10 μl 1x PBS på en ren dissekeringspude. Placer dissekeringspuden på en oplyst stereomikroskopbase.
4. Tør en individuel larve ved at placere den på en vævsservietter, før den overføres til en PBS-dråbe på dissektionspuden.
5. Brug et par pincet, forsigtigt rive åbne og omhyggeligt vende neglebåndet til at frigive hæmolymph.
   BEMÆRK: Pas på ikke at skrabe eller jab neglebåndet, da dette potentielt kunne frigive sessile hæmocytter.
6. Brug en pipet, indsamle hæmolymph fra dissekering pad. Undgå at indsamle larverester såsom fedtlegemet.
7. Tilsæt hæmolymph til en mikrocentrifuge rør og bland ved pipetter op og ned.
   BEMÆRK: Flere prøver kan indsamles på én gang og opbevares på is i op til en time.
8. Valgfrit: Bland Trypan blå med hæmolymph prøve i lige store dele til at farve og udelukke døde celler. Tæl celler inden for 3 minutter for at tilføje Trypan blå, fordi det er giftigt for celler.
9. Prøven blandes ved at pipette op og ned, inden 10 μl læsses i et hæmocytometerkammer.
10. Hvis du bruger en automatiseret celletæller, skal du angive passende parametre for cellestørrelse og cirkularitet. Angiv f.eks. en cellestørrelse på mindst 2 μm, en maksimal cellestørrelse på 22 μm og en cirkularitet på 75 - 80% rundhed for at detektere normale, runde hæmocytter. Eksperimenter med forskellige parametre for at opdage større og spindelformede hæmocytter, såsom lamellocytter. Alternativt kan du bruge et hæmocytometer til manuelt at tælle hæmocytter.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS tablets	MP Biomedicals	2810305
dissecting dish	Corning	7220-85
microcentrifuge tube	Denville	C2170
silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit	Krayden (distributed through Fisher)	NC9644388 (Fisher catalog number)	Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions.
stereomicroscope	Morrell Instruments (Nikon distributor)	mna42000, mma36300	Nikon models SMZ1000 and SMZ645
tissue wipe	VWR	82003-820
forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-DZ
p200 pipette	Eppendorf	3120000054
Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	C10227
Countess cell counting chamber slides	Invitrogen	C10283
hemocytometer	Hausser Scientific	3200
trypan blue stain	Life Technologies	T10282