Overview
De Drosophila hemolymph dient als zowel bloed als interstitiële vloeistof en circuleert door het hele lichaam tijdens de larve- en volwassen stadia. Deze video beschrijft een protocol om larvale hemolymph te verzamelen om de circulerende cellen te kwantificeren.
Protocol
Dit protocol is een fragment uit Reimels en Pfleger, Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae, J. Vis. Exp. (2016).
1. Circulerende hemocytconcentratie
- Om larven van ongeveer hetzelfde ontwikkelingsstadium voor deze test te verkrijgen, beperkt u de eierverzameling door vrouwtjes toe te staan eieren te leggen voor een vaste periode van 2 - 6 uur.
- Verzamel larven in ontledende schotelputten gevuld met 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Plaats voor elke larve 10 μl 1x PBS in een microcentrifugebuis op ijs en 10 μl 1x PBS op een schoon ontleedkussen. Plaats het ontleedkussen op een verlichte stereomicroscoopbasis.
- Droog een individuele larve door deze op een tissuedoekje te plaatsen voordat u deze overbrengt naar een PBS-druppel op het dissectiekussen.
- Scheur met behulp van een tang voorzichtig de nagelriem open en keer deze voorzichtig om om de hemolymph los te laten.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u de nagelriem niet schraapt of prikt, omdat dit mogelijk sessile hemocyten kan vrijgeven. - Verzamel met behulp van een pipet de hemolymph van het ontleedkussen. Vermijd het verzamelen van larvaal puin zoals het vetlichaam.
- Voeg de hemolymph toe aan een microcentrifugebuis en meng door op en neer te pipetten.
OPMERKING: Verschillende monsters kunnen in één keer worden verzameld en maximaal een uur op ijs worden bewaard. - Optioneel: Meng Trypan blauw met het hemolymph monster in gelijke delen om te verven en dode cellen uit te sluiten. Tel cellen binnen 3 minuten na het toevoegen van Trypan blauw omdat het giftig is voor cellen.
- Meng het monster door het op en neer te gieten voordat u 10 μl in een hemocytometerkamer laadt.
- Als u een geautomatiseerde celteller gebruikt, stelt u de juiste parameters in voor celgrootte en circulariteit. Stel bijvoorbeeld een minimale celgrootte van 2 μm, een maximale celgrootte van 22 μm en een circulariteit van 75 - 80% rondheid in om normale, ronde hemocyten te detecteren. Experimenteer met verschillende parameters om grotere en spindelvormige hemocyten, zoals lamellocyten, te detecteren. U kunt ook een hemocytometer gebruiken om hemocyten handmatig te tellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS tablets | MP Biomedicals | 2810305 | |
| dissecting dish | Corning | 7220-85 | |
| microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit | Krayden (distributed through Fisher) | NC9644388 (Fisher catalog number) | Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions. |
| stereomicroscope | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
| tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
| forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
| p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| trypan blue stain | Life Technologies | T10282 |
